朱仁武 顧葉春 姜陽貴 趙茂森 戴雍月

丹紅注射液對肝缺血-再灌注損傷大鼠ICAM-1表達(dá)的影響

朱仁武 顧葉春 姜陽貴 趙茂森 戴雍月

目的 研究丹紅注射液對大鼠肝缺血-再灌注損傷（HIRI）和細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血-再灌注組（I-R組）和缺血-再灌注丹紅注射液預(yù)處理組（DH組）。阻斷I-R、DH組大鼠的門靜脈、肝動脈和膽總管20min后恢復(fù)血供，建立肝HIRI模型。12h后采血檢測各組血清ALT和AST的含量，顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)法檢測肝組織ICAM-1的表達(dá)。結(jié)果 I-R組血清ALT、AST水平較Sham組明顯上升（P＜0.01），肝組織病理學(xué)損害嚴(yán)重，ICAM-1表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；DH組ICAM-1表達(dá)則較I-R組明顯下調(diào)（P＜0.01），ALT、AST水平均下降（均P＜0.01），肝組織病理學(xué)損害亦明顯減輕。結(jié)論 丹紅注射液能在一定程度上保護(hù)HIRI后的肝組織，該作用可能與下調(diào)ICAM-1的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

肝 缺血-再灌注損傷 丹紅注射液 細(xì)胞間黏附分子1

原發(fā)性肝癌和肝膽管結(jié)石是我國常見的疾病，肝部分切除是治療該類疾病的有效的方法之一。為控制手術(shù)出血常行暫時性入肝血流阻斷，這必然引起肝缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）[1-2]，導(dǎo)致不同程度的肝功能損害，甚至引起術(shù)后肝衰竭的發(fā)生。丹紅注射液為活血化瘀類藥物，臨床證實(shí)它能有效改善受損肝臟微循環(huán)，促進(jìn)肝細(xì)胞修復(fù)再生，減少肝纖維化，延緩肝硬化的進(jìn)展[3]，但對HIRI的影響目前文獻(xiàn)報(bào)道不多。本研究通過建立大鼠HIRI模型，并用丹紅注射液進(jìn)行干預(yù)，檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平和肝組織細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達(dá)情況，旨在觀察丹紅注射液對HIRI的干預(yù)效果并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康SD大鼠24只，鼠齡49～63d，體重225～275g，雌雄不限；由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（動物許可證號：SYXK浙2005-0061）提供。丹紅注射液（生產(chǎn)批號14082012，規(guī)格20ml/支）由山東丹紅制藥有限公司提供。Ⅰ抗兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體由美國SANTA CRUZ公司提供；Ⅱ抗山羊抗兔IgG購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。全自動生化分析儀為日本Olympus公司生產(chǎn)，型號AV800。

1.2 動物分組和模型制備 24只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血-再灌注組（I-R組）和缺血-再灌注丹紅注射液預(yù)處理組（DH組），每組8只。大鼠術(shù)前12h禁食,自由飲水。5%水合氯醛（0.07ml/kg）腹腔注射麻醉。麻醉起效后，將大鼠固定，常規(guī)備皮、消毒、鋪洞巾。取上腹部正中切口進(jìn)腹，顯露第一肝門，游離肝十二指腸韌帶。Sham組于術(shù)前72、48、24h經(jīng)尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液2ml/kg，不阻斷肝臟血供，20min后關(guān)閉腹腔；I-R組的術(shù)前處理同Sham組，阻斷門靜脈、肝動脈和膽總管，20min后恢復(fù)血供并關(guān)閉腹腔；DH組于術(shù)前72、48、24h經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液2ml/kg，手術(shù)操作同I-R組。各組均于關(guān)閉腹腔后12h處死動物。

1.3 血清ALT、AST檢測 各大鼠術(shù)后12h經(jīng)下腔靜脈采血 2ml，常溫靜置 30min后，3 500r/min離心10min，提取血清標(biāo)本1ml，采用全自動生化分析儀測定ALT和AST的濃度。

1.4 肝組織病理學(xué)觀察 各大鼠取1cm×1cm×1cm大小肝組織塊，4%多聚甲醛固定，行常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，在顯微鏡下（×200）觀察肝組織病理學(xué)變化；并對肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤情況進(jìn)行評分：顯微鏡下（×200）連續(xù)觀察10個視野，無炎癥細(xì)胞浸潤為0分，平均炎癥細(xì)胞＜50個為1分，50～149個為2分，150個及以上為3分。

1.5 ICAM-1檢測 常規(guī)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（SABC法）檢測ICAM-1，步驟參照試劑盒推薦方法進(jìn)行，顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察。細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色為表達(dá)陽性，每張切片于陽性表達(dá)區(qū)域選取5個高倍（×400）無重疊視野，應(yīng)用華東理工大學(xué)研制的吸光度分析軟件讀取平均吸光度值作為ICAM-1的相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett’s T3檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清ALT、AST水平比較 見表1。

表1 3組大鼠血清ALT、AST水平比較（U/L）

由表1可見，與Sham組相比，I-R、DH組的血清ALT、AST水平均明顯升高（均P＜0.01）；DH組與I-R組相比，血清ALT、AST水平均顯著下降（均P＜0.01）。

2.2 3組大鼠肝組織病理學(xué)觀察及評分比較 見圖1、表2。

圖1 3組大鼠肝組織病理學(xué)觀察所見（A：Sham組；B：I-R組；C：DH組；HE染色，×200）

由圖1可見，Sham組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)、小葉中央靜脈、肝細(xì)胞索及肝竇結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞無明顯變性，未見壞死。I-R組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞水腫明顯,可見較多空泡變性，并出現(xiàn)廣泛點(diǎn)狀、灶狀壞死，肝血竇和中央靜脈有不同程度的瘀血，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤明顯。DH組與I-R組相比，肝臟損害明顯減輕，肝細(xì)胞輕微腫脹，散在點(diǎn)狀及灶狀壞死，匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤。由表2可見，DH組炎癥程度評分較I-R組亦明顯降低（P＜0.01），但與Sham組比較，DH組肝臟損害仍存在（P＜0.01）。

2.3 3組大鼠肝組織ICAM-1表達(dá)情況的比較 見圖2、表3。

表2 3組大鼠肝小葉內(nèi)和匯管區(qū)炎癥程度評分比較

圖2 3組大鼠肝組織ICAM-1的表達(dá)（A：Sham組；B：I-R組；C：DH組；SABC法，×400）

表3 3組大鼠肝組織ICAM-1表達(dá)水平比較

由圖2可見，免疫組化染色顯示Sham組肝組織ICAM-1表達(dá)呈陰性，偶見肝竇內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)極少量表達(dá)；I-R組肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、匯管區(qū)小動脈肌層及小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)均可見棕黃色強(qiáng)陽性表達(dá)，部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞亦可見ICAM-1表達(dá)；DH組肝組織ICAM-1表達(dá)呈弱陽性。由表3可見，I-R、DH組肝組織ICAM-1平均吸光度值均升高（均P＜0.01）；DH組ICAM-1平均吸光度值較I-R組顯著降低（P＜0.01）。

2.4 相關(guān)性分析 ICAM-1平均吸光度值與 ALT、AST、肝小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤評分及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤評分之間均存在非常顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.824、0.883、0.821、0.811，均P＜0.01）。

3 討論

隨著臨床肝部分切除手術(shù)的廣泛開展及新技術(shù)的發(fā)展（如肝移植手術(shù)），HIRI問題越來越受到關(guān)注[1-2]。其發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要與以下因素有關(guān)：（1）氧自由基大量生成；（2）細(xì)胞內(nèi)鈣超載；（3）肝細(xì)胞能量代謝障礙；（4）中性粒細(xì)胞黏附、浸潤。徹底闡明其發(fā)生機(jī)制，尋求有效的抗HIRI藥物是近年來的研究熱點(diǎn)。丹紅注射液目前臨床主要用于治療心絞痛、腦梗死等心腦血管疾病。已有研究表明，單獨(dú)運(yùn)用丹參或紅花均可通過多途徑對HIRI發(fā)揮防護(hù)作用[3]。但丹紅注射液(丹參和紅花配伍)預(yù)處理對HIRI的干預(yù)作用尚不清楚。

血清轉(zhuǎn)氨酶水平是評判肝急性損傷程度的敏感指標(biāo)，損傷程度越重，轉(zhuǎn)氨酶水平越高，可直接反映HIRI程度[4]。本研究I-R組采用Pringle法[5]完全阻斷第一肝門20min，復(fù)灌12h，結(jié)果顯示I-R組的血清ALT、AST水平均較Sham組明顯升高（均P＜0.01）。顯微鏡下觀察到肝組織損傷程度與血清轉(zhuǎn)氨酶升高水平相吻合，I-R組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞水腫明顯,可見較多空泡變性，并出現(xiàn)廣泛點(diǎn)狀、灶狀壞死；肝血竇和中央靜脈有不同程度的瘀血；匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤明顯。這也表明了我們的動物模型制備是成功的。DH組則是術(shù)前連續(xù)應(yīng)用丹紅注射液72h，從而達(dá)到藥物預(yù)處理，結(jié)果表明，DH組血清 ALT、AST水平均較I-R組顯著降低（均P＜0.01）。顯微鏡下也觀察到肝損害程度較I-R組明顯減輕，肝細(xì)胞輕微腫脹，散在點(diǎn)狀、灶狀壞死，匯管區(qū)僅少量炎癥細(xì)胞浸潤。因此結(jié)果提示,丹紅注射液預(yù)處理可顯著抑制HIRI后血清ALT、AST的升高，減輕炎癥反應(yīng)，減輕肝組織病理學(xué)損害，從而對HIRI后肝臟發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，由ICAM介導(dǎo)的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附是白細(xì)胞聚集、活化和釋放炎癥介質(zhì)的關(guān)鍵，在臟器HIRI中起重要作用。ICAM-1又稱CD54，是一種細(xì)胞表面跨膜蛋白抗原，是免疫球蛋白超家族中最重要的黏附分子，可在炎癥因子NF-κB、TNF-α、IL-1、干擾素-γ的刺激下表達(dá)增加。ICAM-1與相應(yīng)受體結(jié)合后可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附作用和炎癥反應(yīng)[6]。Meyer等[7]建立大鼠肝HIRI模型發(fā)現(xiàn)，缺血期間僅見缺血肝葉少量ICAM-1 mRNA表達(dá)，但在再灌注期間，缺血肝葉和非缺血肝葉均可見大量 ICAM-1 mRNA表達(dá)。并且除了肝小葉以外，腎臟、心臟、小腸和胰腺組織也有ICAM-1的表達(dá)上調(diào)。本研究也觀察到I-R組ICAM-1表達(dá)較Sham組明顯上調(diào)，陽性表達(dá)以肝竇內(nèi)皮細(xì)胞為主，部分肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞亦可見ICAM-1表達(dá)。一方面，肝竇中的中性粒細(xì)胞在ICAM介導(dǎo)下黏附、游走、浸潤到肝組織，釋放氧自由基、炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-6等，并分泌髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、膠原酶等多種酶，這些細(xì)胞毒素可直接作用于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，造成肝臟損傷；另一方面可介導(dǎo)白細(xì)胞和血小板黏附到血管壁上，造成毛細(xì)血管阻塞，影響肝臟的微循環(huán)，造成無復(fù)流現(xiàn)象。我們在作相關(guān)性分析時也發(fā)現(xiàn)，在I-R、DH組，肝組織ICAM-1表達(dá)的變化趨勢與血清ALT、AST水平的變化趨勢相一致，與顯微鏡下肝組織病理變化亦相吻合，ICAM-1表達(dá)越高，肝組織損傷越明顯。因此ICAM-1可作為評價HIRI程度的一個重要指標(biāo)，通過干預(yù)ICAM-1的表達(dá)來防治HIRI無疑是一個很好的途徑。

丹紅注射液通過抑制ICAM-1表達(dá)來保護(hù)腦、腎等器官的HIRI已見文獻(xiàn)報(bào)道。聞公靈等[8]研究發(fā)現(xiàn)丹紅注射液預(yù)處理可降低大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)，減輕白細(xì)胞浸潤。夏康等[9]認(rèn)為丹紅注射液可通過下調(diào)ICAM-1表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)對移植腎的損傷。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，丹紅注射液預(yù)處理可有效抑制肝組織ICAM-1過度表達(dá)，同時降低血清ALT和AST水平，顯微鏡下肝組織病理學(xué)損傷亦明顯減輕，匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。這提示丹紅注射液缺血前預(yù)處理可在ICAM-1這一靶點(diǎn)抑制中性粒細(xì)胞的黏附、浸潤，進(jìn)而減輕蛋白水解酶及炎癥因子的釋放，減輕肝臟損傷。但丹紅注射液抑制ICAM-1上調(diào)的分子機(jī)制以及其與炎癥因子表達(dá)的相互關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Danhong injection on expression of ICAM-1 after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats

ZHU Renwu,GU Yechun, JIANG Yanggui,et al.
Department of General Surgery,Wenzhou Hospital of Integration of Traditional Chinese and Western Medicine, Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effects of Danhong injection on expression of ICAM-1 after hepatic ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Twenty four male SD rats were randomly divided into three groups with 8 rats in each: Sham-operation group(Sham group)，ischemia-reperfusion group(I-R group)and Danhong injection pretreatment group(DH group).Hepatic ischemia/reperfusion rat model was induced by blockage of hepatic artery，portal vein and bile duct for 20 min，and restoration of blood supply.Serum levels of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)were measured 12h after reperfusion.After animals were sacrificed,liver samples were collected for histopathological examination and immunohistochemical staining for intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1). Results Serum ALT and AST levels in I-R group were significantly higher than those in Sham group(P＜0.01).The pathologic injury of liver tissue in I-R group was more severe than that in sham group,ICAM-1 expression of liver tissue in I-R group was significantly increased compared with that in sham group(P＜0.01).Danhong injection pretreatment markedly lowered serum ALT and AST levels(P＜0.01)and ICAM-1 expression in liver tissue(P＜0.01);it also attenuated pathological damage of hepatic tissue. Conclusion Danhong injection attenuated hepatic tissue injury after ischemia-reperfusion,which may be related to down-regulation of ICAM-1 expression and alleviation of inflammation reaction.

Lliver Ischemia-reperfusion injury Danhong injection Intercellular adhesion molecule-1

2015-02-11）

（本文編輯：李媚）

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20130110）

325000 溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科（朱仁武、顧葉春、姜陽貴，趙茂森）；溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院（戴雍月）

戴雍月，E-mail：13656775600@163.com