李海英，孫永芳，許岳飛＊，楊云貴＊

（1.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西西安710016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，陜西楊凌712100）

垂穗披堿草（Elymusnutans）作為青藏高原常見的多年生禾本科牧草，具有耐寒、耐旱、品質(zhì)好和產(chǎn)草量高等特點(diǎn)［1－2］，成為青藏高原退化草地改良常用補(bǔ)播草種［3］。由于青藏高原海拔高，氣溫低等因素限制了有機(jī)氮的礦化，導(dǎo)致土壤氨基酸濃度常超過礦質(zhì)氮（NH4＋、NO3－）濃度，許多植物能夠在不經(jīng)礦化的情況下直接吸收、利用環(huán)境介質(zhì)中的有機(jī)氮，尤其是氨基酸類［4］。氨基酸可能代表著該區(qū)域植物的一個(gè)主要氮源。

在自然界中大多數(shù)植物主要吸收無機(jī)氮，植株體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和消除通常呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但當(dāng)有機(jī)氮作為植物的唯一氮源時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)遭到一定程度的損壞，最終引起內(nèi)含物泄露和植物細(xì)胞脫水。丙二醛（MDA）作為植物膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之，與細(xì)胞上的蛋白質(zhì)和酶等交聯(lián)并使其失活，從而導(dǎo)致生物膜的結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞，應(yīng)此，MDA 被認(rèn)為是判斷膜脂過氧化的一個(gè)重要指標(biāo)［5］。為了減輕受到逆境脅迫的傷害，植物主要是通過超氧歧化酶 （SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）等抗氧化酶及時(shí)轉(zhuǎn)移、清除掉自由基及氧化中間產(chǎn)物［6］。植物和真菌的抗氧化劑可以保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的侵害。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）是一種廣泛分布在微生物與高等植物之間的聯(lián)合共生體，能夠擴(kuò)大根系吸收范圍，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分和水分的吸收、增加植物群落多樣性和提高植物抗逆性［7］。AM 真菌可以促進(jìn)宿主植物對(duì)氮素的吸收，菌絲吸收氮素的形態(tài)包括NH4＋、NO3－和一些氨基酸［8］。

在自然土壤溶液中發(fā)現(xiàn)了多種氨基酸，一般以天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸占優(yōu)勢(shì)［9］。因此，本試驗(yàn)選用這三種氨基酸作為有機(jī)氮源，并將無機(jī)氮NH4＋和NO3－作為對(duì)照，研究?jī)煞N垂穗披堿草對(duì)這些氮源的吸收狀況。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)2種垂穗披堿草植株根部接種摩西球囊霉（Glomus mosseae）來比較2種垂穗披堿草在低氮脅迫下抗氧化方面的特征，從而為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)垂穗披堿草新品種選育及野生種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用北京垂穗披堿草（BJ）種子購(gòu)自北京正道生態(tài)科技有限公司，申扎垂穗披堿草（SZ）種子取自西藏自治區(qū)申扎縣（N 31°06.187′，E 91°41.960′，海拔4 763 m）。供試叢枝菌根真菌為摩西球囊霉（Glomusmosseae）（Nicolson ＆ Gerdemann）Gerdemann ＆Trappe（菌種編號(hào)：BGC XZ02A，國(guó)家微生物資源平臺(tái)編號(hào)：1511C0001BGCAM 0014），由中國(guó)叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫(kù)（BGC）提供。石英砂用水沖洗數(shù)次后，于烘箱中160 ℃高溫滅菌2h，自然冷卻后繼續(xù)在160 ℃烘2h，放涼備用。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)分為兩個(gè)階段進(jìn)行：第一階段，試驗(yàn)選用兩種無機(jī)態(tài)氮（NH4＋－N、NO3－－N）和三種有機(jī)態(tài)氮（Asp－N、Glu－N、Gly－N）作為不同的氮源，其它無氮營(yíng)養(yǎng)元素在Thornton 和Bausenwein［10］配方的基礎(chǔ)上再添加0.05 μmol／L 的Na2MoO4，用0.1 mmol／L的KOH 和HCl調(diào)節(jié)pH 至5.6左右。挑選飽滿一致的垂穗披堿草種子，用1%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，自來水沖洗數(shù)次后，再用無菌蒸餾水沖洗兩次，將洗好的種子種植在盛有石英砂的育苗盤內(nèi)，置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽。待出苗基本完畢后，選取生長(zhǎng)一致的壯苗定苗，并開始澆營(yíng)養(yǎng)液，每3d澆一次，一個(gè)月后收獲全株，測(cè)定植株生物量。

第二階段，根據(jù)第一階段的試驗(yàn)結(jié)果，本階段以谷氨酸作為氮源，其它無氮營(yíng)養(yǎng)元素的配方同試驗(yàn)的第一階段，設(shè)不接種真菌（NF）、接種滅活真菌（IF）和激活真菌（AF）三個(gè)處理。將飽滿一致種子SZ和BJ在1%的次氯酸鈉溶液浸泡10min后用蒸餾水沖洗干凈，置于盛有濾紙的培養(yǎng)皿中，并將其放在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽。在轉(zhuǎn)苗前，首先進(jìn)行接種處理，每千克石英砂中接入15g菌種（大約225個(gè)孢子）或高溫滅活的菌種，未接種處理者均加等量石英砂。將長(zhǎng)勢(shì)一致的強(qiáng)壯幼苗轉(zhuǎn)入盛有上述石英砂的穴盤內(nèi)，置于人工模擬氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每三天澆一次營(yíng)養(yǎng)液，三個(gè)月后進(jìn)行抗氧化相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

1.3.1 垂穗披堿草地上生物量的測(cè)定 取每株植物的地上部分，105 ℃殺青30min，70 ℃烘干至恒重測(cè)定其生物量。

1.3.2 葉片電解質(zhì)滲出率的測(cè)定和丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 將葉片剪成小段，放入洗凈試管中，加入去離子水，抽氣并靜置幾分鐘后用電導(dǎo)儀測(cè)定葉片的電導(dǎo)值C1。再將試管放入沸騰的水浴鍋中加熱5min，冷卻后測(cè)量其電導(dǎo)值C2［11］。計(jì)算公式如下：電解質(zhì)滲出率（%）＝C1／C2×100%。

1.3.3 葉片丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 稱取0.1 g垂穗披堿草葉片，加入1 mL 的5%三氯乙酸，混勻后加入5mL 的0.5%硫代巴比妥酸，將其置于沸水浴15min后，冷卻離心，取其上清液并分別在450nm、532nm 和600nm 的波長(zhǎng)下進(jìn)行比色［11］。計(jì)算公式如下：

MDA 含量（nmol·g－1FW）＝［6.452（A532－A600）－0.559A450］×Vt／（Vs×FW）

式中：Vt為提取液的總體積；Vs為測(cè)定提取液體積；FW 為葉片鮮重（g）。

1.3.4 葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性的測(cè)定 酶液提取：取1g左右的葉片，加入9mL的50mmol／L磷酸緩沖液（含有1%聚乙烯吡咯烷酮），再將其在4℃浸提40min，然后在4℃下15 000r／min離心15 min，上清液即為粗酶提取液［12］。SOD 活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）法［13］測(cè)定，POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法［14］進(jìn)行測(cè)定，CAT 活性采用過氧化氫分解法［15］進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（One－way ANOVA）和Duncan法比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，圖中誤差線上不同的小寫字母表示不同處理在P＜0.05時(shí)有顯著差異，并利用Sigmaplot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)氮源的選擇

在五種不同氮源條件下，BJ和SZ 的地上生物量如圖1所示，兩種垂穗披堿草在無機(jī)態(tài)氮（NH4＋－N、NO3

－－N）供應(yīng)條件下的地上生物量明顯高于有機(jī)態(tài)氮（Asp－N、Glu－N、Gly－N），且對(duì)兩種無機(jī)態(tài)氮之間的吸收無顯著性差異（P＞0.05）。SZ對(duì)Glu－N的吸收能力明顯高于其它兩種有機(jī)態(tài)氮（P＜0.05），而BJ對(duì)Glu－N 的吸收能力最弱。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中選用Glu－N 作為有機(jī)氮源來探討垂穗披堿草對(duì)有機(jī)態(tài)氮的吸收機(jī)理。

圖1 不同氮源供應(yīng)下BJ和SZ的地上生物量Fig.1 Above－ground biomass of BJ and SZ with different nitrogen source

2.2 叢枝菌根真菌對(duì)垂穗披堿草膜透性及膜脂過氧化的影響

如圖2，當(dāng)有機(jī)氮作為氮源時(shí)，接種激活的叢枝菌根真菌能降低兩種垂穗披堿草的電解質(zhì)滲出率和丙二醛（MDA）含量。與不接種叢枝菌根真菌或接種未激活的叢枝菌根真菌相比，接種激活叢枝菌根真菌對(duì)BJ電解質(zhì)滲出率的影響不明顯（P＞0.05），而接種激活叢枝菌根真菌顯著降低了SZ電解質(zhì)滲出率（P＜0.05）。在相同處理?xiàng)l件下，BJ電解質(zhì)滲出率高于SZ電解質(zhì)滲出率。各處理之間SZ的MDA含量差異不顯著（P＞0.05），而接種激活叢枝菌根真菌BJ的MDA含量顯著低于其它處理組（P＜0.05）。

2.3 枝菌根真菌對(duì)垂穗披堿草抗氧化酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，接種激活叢枝菌根真菌均降低了兩種垂穗披堿草的SOD、CAT 和POD 活性。與未接種叢枝菌根真菌相比，接種叢枝菌根真菌能夠顯著降低BJ和SZ的SOD 活性（P＜0.05）。與未接種叢枝菌根真菌相比，盡管接種叢枝菌根真菌對(duì)BJ和SZ 的CAT 活性沒有顯著性影響（P＞0.05），但分別降低了18.7%和28.3%。與未接種叢枝菌根真菌相比，接種叢枝菌根真菌能夠顯著減低BJ和SZ的POD 活性（P＜0.05），而未接種叢枝菌根真菌相和接種未激活的叢枝菌根真菌植株的PODT 活性之間差異不明顯（P＞0.05）。在相同處理?xiàng)l件下，BJ的SOD、CAT 和POD 活性均高于SZ的SOD、CAT 和POD 活性。

圖2 不同處理對(duì)BJ和SZ電解質(zhì)滲出率和MDA 含量的影響Fig.2 Effect of different treatments on electrolyte transudation ratio and MDA contents of BJ and SZ

3 討論

草地是畜牧的基礎(chǔ)，也是是牧區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要自然資源，其合理利用能夠帶來良好的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益［16］。牧草生物量是草地生態(tài)系統(tǒng)獲取能量的主要體現(xiàn)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的形成具有十分重要的影響［17］，其高低可判斷草地狀況、演替趨勢(shì)、生產(chǎn)潛力和載畜能力［18－19］。在本試驗(yàn)中，兩種垂穗披堿草的地上生物量在有機(jī)氮作為氮源時(shí)明顯比無機(jī)氮低，可能是由于N 源為單一氨基酸時(shí)抑制了植物的生長(zhǎng)［20］，其中以Glu 處理對(duì)SZ 的降低幅度最低，這與葛體達(dá)等［21］的研究結(jié)果一致。當(dāng)Glu－N 作為氮源時(shí)，SZ的地上生物量遠(yuǎn)高于BJ，可能是申扎長(zhǎng)期生活在富含有機(jī)質(zhì)的草原生態(tài)系統(tǒng)中［22］，已經(jīng)較好地形成了一套吸收有機(jī)氮的機(jī)制。

不良環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)植物膜脂過氧化，膜脂過氧化的產(chǎn)物積累，細(xì)胞膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)含物發(fā)生外泄，導(dǎo)致細(xì)胞電解質(zhì)滲出率增加［23］。MDA高低是膜脂過氧化作用的一個(gè)重要指標(biāo)，其含量高低直接反映了植物受害的狀況［24］。當(dāng)單一氨基酸作為植物的氮源時(shí)，抑制了植物的生長(zhǎng)［20］，在缺少氮源的逆境脅迫下，兩種垂穗披堿草的電解質(zhì)滲出率和MDA 含量升高，接種激活的叢枝菌根真菌后，這種傷害有所下降，表明叢枝菌根真菌能夠改善植株的電解質(zhì)滲出率和減低葉片MDA 含量［25］。

圖3 不同處理對(duì)BJ和SZ SOD、CAT 和POD 活性的影響Fig.3 Effect of different treatments on activity of SOD，CAT and POD of BJ and SZ

SOD 是植株抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的金屬酶，能清除植物細(xì)胞中過量的超氧根陰離子，是防御超氧陰離子自由基對(duì)細(xì)胞損害的抗氧化酶［26］。POD 在活性氧的清除和抑制膜脂過氧化等植物抗逆性生理方面起重要作用。CAT 是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶類之一，可以作為植物抵抗不良環(huán)境脅迫的一個(gè)指標(biāo)［27］。在有機(jī)氮作為氮源條件下，兩種垂穗披堿草的SOD、CAT 和POD 活性均比較高，給植株接種激活的叢枝菌根真菌后，這三種酶的活性均降低。這與賀忠群等［28］得出接種叢枝菌根真菌增加了番茄中SOD、CAT 和POD 的活性的結(jié)論相矛盾。可能是由于本試驗(yàn)是在接種叢枝菌根真菌三個(gè)月后才測(cè)定的抗氧化酶活性，叢枝菌根真菌與寄主植物已經(jīng)形成了良好的共生關(guān)系，緩解了植物對(duì)單一氨基酸作為氮源時(shí)逆境脅迫的傷害。同時(shí)，這也與李岳峰［24］的研究結(jié)果相吻合，他通過將叢枝菌根真菌接種到綠豆中，測(cè)定了不同時(shí)間段植物體內(nèi)的SOD、CAT 和POD 的活性，這三種酶的活性在菌種侵染45d后遠(yuǎn)大于菌種侵染60d。因此，叢枝菌根真菌對(duì)植物具有累加效應(yīng)，即菌種侵染宿主后，可以長(zhǎng)期對(duì)其發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

兩種垂穗披堿草的地上生物量在有機(jī)氮作為氮源時(shí)明顯比無機(jī)氮低，且SZ 對(duì)Glu－N 的吸收能力高于其它兩種有機(jī)態(tài)氮。當(dāng)有機(jī)氮作為氮源時(shí)，接種激活的叢枝菌根真菌能降低兩種垂穗披堿草的電解質(zhì)滲出率和MDA 含量，降低了兩種垂穗披堿草的SOD、CAT 和POD 活性。不接種叢枝菌根真菌與接種滅活的叢枝菌根真菌對(duì)垂穗披堿草的影響不大。說明接種叢植菌根能間接減少植物在有機(jī)氮條件下的傷害，從而促進(jìn)植物對(duì)有機(jī)氮的吸收。

［1］Gu Meng－h(huán)e，Dong Shi－kui，Wang Tao，et al.Interspecific interactions under fertilization among Elymus nutans，F(xiàn)estuca sinensis and Festuca ovina on the eastern Qinghai－Tibetan plateau［J］.Plant Species Biology，2012，27（2）：159－163.

［2］陸光平，聶 斌.垂穗披堿草利用價(jià)值評(píng)價(jià)［J］.草業(yè)科學(xué)，2002，19（12）：13－15.

［3］張永超，牛得草，韓 潼，等.補(bǔ)播對(duì)高寒草甸生產(chǎn)力和植物多樣性的影響［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（2）：305－309.

［4］崔曉陽(yáng).植物對(duì)有機(jī)氮源的利用及其在自然生態(tài)系統(tǒng)中的意義［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，27（8）：3 500－3 512.

［5］Banry H，Susanna C.Lipid peroxidation：its mechanism，measurement and significance［J］.Ameriean Journal of Clinical Nutrition，1993，57（5）：715－724.

［6］Seandalios J G.Oxygen stress and superoxide dismutases［J］.Plant Physiology，1993，101（1）：7－12.

［7］Rousseau J V D，Sylvia D M，F(xiàn)ox A J.Contribution of ecto－mycorrhiza to the potential nutrient－absorbing surface of pine［J］.New Phytologist，1994，128（4）：639－644.

［8］Frey B，Hannes S.Acquisition of nitrogen by external hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi associated with zea mays L［J］.New Phytologist，1993，124（2）：221－230.

［9］Raab T K，Lipson D A，Monson R K.Soil amino acid utilization among species of the cyperaceae：plant and soil processes［J］.Ecology，1999，80（7）：2 408－2 419.

［10］Thornton B，Bausenwein U.Seasonal protease activity in storage tissue of the deciduous grass Molinia caerulea［J］.New Phytologist，2000，146（1）：75－81.

［11］張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.第3版.北京：高等教育出版社，1990.

［12］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72（1）：248－254.

［13］Beauchamp C，F(xiàn)ridovich I.Superoxide dismutase：improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］.Analytical Biochemistry，1971，44（1）：276－287.

［14］Hammerschmidt R，Nuckles E M，Kuc J.Association of enhanced peroxidase activity with induced systemic resistance of cucumber to Colletotrichum lagenarium［J］.Physiological Plant Pathology，1982，20（1）：73－82.

［15］Aebi H.Catalase in vitro［J］.Methods Enzymol，1984，105：121－126.

［16］夏祖國(guó)，李祖祥，蘇小冬，等.發(fā)展經(jīng)濟(jì)型草業(yè)推動(dòng)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整［J］.草業(yè)科學(xué)，2003，20（9）：41－43.

［17］宇萬(wàn)太，于永強(qiáng).植物地下生物量研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2001，12（6）：927－932.

［18］安 淵，李 博，揚(yáng) 持，等.內(nèi)蒙古大針茅草原草地生產(chǎn)力及其可持續(xù)利用研究Ⅰ、放牧系統(tǒng)植物地上現(xiàn)存量動(dòng)態(tài)研究［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2001，10（2）：22－27.

［19］史惠蘭，王啟基，景增春，等.江河源區(qū)人工草地群落特征、多樣性及其穩(wěn)定性分析［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14（3）：23－30.

［20］吳良?xì)g，陶勤南.水稻氨基酸態(tài)氮營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)及其機(jī)理研究［J］.土壤學(xué)報(bào)，2000，37（4）：464－473.

［21］葛體達(dá)，黃丹楓，蘆 波，等.無機(jī)氮和有機(jī)氮對(duì)水培番茄幼苗碳水化合物積累及氮素吸收的影響［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2008，14（5）：604－609.

［22］Woodmansee R G，Dodd J L，Bowman R A，et al.Nitrogen budget of a shortgrass prairie ecosystem［J］.Oecologia，1978，34（3）：363－376.

［23］張呈祥，陳為峰.美人蕉對(duì)鎘的脅迫反應(yīng)及積累特性［J］.植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2012（07）：690－696.

［24］李岳峰.叢枝菌根改善旱作水稻／綠豆間作系統(tǒng)中作物生長(zhǎng)和氮磷利用的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［25］付淑清，屈慶秋，唐 明，等.施氮和接種AM 真菌對(duì)刺槐生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)代謝的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2011，47（1）：95－100.

［26］馬旭俊，朱大海.植物超氧化物歧化酶（SOD）的研究進(jìn)展［J］.遺傳，2003，25（2）：225－231.

［27］梁艷榮，胡曉紅，張潁力，等.植物過氧化物酶生理功能研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（2）：110－113.

［28］賀忠群，賀超興，張志斌.鹽脅迫下叢枝菌根真菌對(duì)番茄氧自由基清除系統(tǒng)的影響［J］.園藝學(xué)報(bào)，2010，37（S）：2 146－2 146.