反向微乳毛細管電泳法在線富集技術(shù)靈敏檢測化妝品中的多環(huán)芳烴

陳新+倪鑫炯+張佳瑜+劉瑛+曹玉華

摘 要 要建立了反向微乳毛細管電泳（MEEKC）在線富集技術(shù)靈敏檢測多環(huán)芳烴的方法。采用大體積進樣-pH動態(tài)連接-掃集微乳毛細管電泳法（LVSS-DypH-MEEKC）對于常規(guī)條件下很難分離的6種強親脂性的多環(huán)芳烴中性分子進行富集分離。結(jié)果表明，在反相電壓下，當微乳液的組成為： ?2.4% （w/w） SDS、0.6% （w/w）正辛烷、6.6% （w/w）正丁醇、20 mmol/L NaH2PO4 緩沖液（pH 2.2）; 進HCB時間為20 s（16 kPa），進樣時間為80 s（16 kPa）時，富集效果良好，富集倍數(shù)在25～80倍之間，在27 min內(nèi)實現(xiàn)了對多環(huán)芳烴化合物的靈敏檢測。將本方法用于化妝品中多環(huán)芳烴的檢測，回收率在90.6%～95.9%之間，相對標準偏差均小于5.1%（n=5）。

關(guān)鍵詞 微乳毛細管電泳; ?大體積進樣; ?pH動態(tài)連接; ?掃集; ?多環(huán)芳烴（PAHs）

1 引 言

多環(huán)芳烴（PAHs）多為脂溶性高、疏水性強的中性分子，可誘發(fā)皮膚癌、陰囊癌和肺癌，是重要的環(huán)境和食品污染物。《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》^[1]規(guī)定，苯并[g，h，i]芘、二苯并[a，h]蒽、苯并[a]芘、 苯并[b]熒蒽、苯并[a]蒽、熒蒽等多環(huán)芳烴化合物為化妝品中禁用物質(zhì)。目前，PAHs的主要分析技術(shù)有高效液相色譜法（HPLC）[2～4]和氣相色譜法（GC）[5～7]。有些PAHs不能用GC直接分析。而對于結(jié)構(gòu)相似的PAHs，利用HPLC分析，靈敏度和分離度均較低。毛細管電泳方法具有儀器簡單、操作方便、分離效率高、分析速度快、操作模式多等特點，越來越廣泛地應(yīng)用于各類樣品的分析。目前已有一些利用膠束毛細管電泳（MEKC）^[8，9]和填充毛細管色譜（CEC）^[10]成功分離PAHs的報道。但是傳統(tǒng)毛細管電泳方法的檢測靈敏度較低，不能滿足質(zhì)量監(jiān)控要求。在線富集技術(shù)僅通過對緩沖液組成和進樣程序進行調(diào)控就可顯著提高檢測靈敏度，近年來成為毛細管電泳分析領(lǐng)域的研究熱點^[11，12]。在線富集技術(shù)大致可分為樣品堆積技術(shù)^[13]、掃集術(shù)^[14]、等速電泳^[15]等，其中堆積技術(shù)往往在進樣時實現(xiàn)，可與后幾種技術(shù)聯(lián)用，進一步改善靈敏度。

大體積進樣電堆積是常規(guī)電堆積模式的一種特殊形式，能有效克服常規(guī)堆積技術(shù)進樣體積的限制，使檢測靈敏度提高兩個數(shù)量級以上^[16]。在MEEKC方法中，樣品與含有更高容量因子的微乳粒子的作用增強，濃縮程度增加，使檢測靈敏度顯著提高。本研究采用大體積進樣、pH動態(tài)連接及掃集相聯(lián)用的方式對PAHs進行富集分離，通過改變攜帶分析物前進的微乳粒子的遷移速度，在pH連接區(qū)帶上產(chǎn)生堆積，不需要轉(zhuǎn)變極性就可以實現(xiàn)大體積進樣堆積，進而實現(xiàn)對PAHs的靈敏檢測。本方法不僅可以用于多環(huán)芳烴的檢測，而且為結(jié)構(gòu)及性質(zhì)較為相近的其它中性化合物的分離富集提供了參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

JA2003電子分析天平（上海分析天平儀器廠）; CAPEL105高效毛細管電泳系統(tǒng)，配有Lumex紫外檢測器（俄羅斯），反向電壓0～30 kV，可調(diào); HS3120D超聲波振蕩器（天津恒奧科技發(fā)展公司）; 未涂層石英毛細管（65 cm×75 SymbolmA@ m ，有效長度50 cm）; 未涂層石英毛細管（65 cm ×50 μm.i.d.，有效長度為55 cm， 河北永年光纖）; 0.45 μm微孔濾膜（吉安市青原區(qū)慶豐過濾器材有限公司）; 臺式高速離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）。

PAHs： 熒蒽，苯并[a]蒽，苯并[b]熒蒽，苯并[a]芘，二苯并[a，h]蒽，苯并[g，h，i]芘（德國DR公司）; 其余試劑均為分析純; 超純水（華晶微電子公司）。

2.2 標準和樣品的制備

標準溶液配制： 準確稱取6個標準品，用二氯甲烷及乙醇溶解并定容至5 mL，配成2 g/L的貯備液，在 Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。

樣品溶液的制備： 準確稱取2.00 g待測化妝品，加入10 mL正己烷-丙酮（1∶1， V/V）溶液，超聲20 min后，利用高速離心機離心5 min，取上清液，在下層殘渣中再加入10 mL正己烷-丙酮（1∶1， V/V）溶液，操作方法同上，重復提取3次，合并上清液; 膏霜類化妝品在上述步驟基礎(chǔ)上再重復提取兩次上層清液，合并上清液。將上清液放入冰箱內(nèi)冷凍5 min; 冷凍后的提取液用0.45 SymbolmA@ m過濾膜過濾，并定容于50 mL容量瓶中。將濾液再用二氨甲烷液液萃取4次，每次10 mL，合并上層二氯甲烷相，濃縮至約2 mL。

2.3 微乳毛細管電動色譜條件

微乳液的組成為： 2.4% （w/w）SDS、0.6% （w/w）正辛烷、6.6% （w/w）正丁醇、20 mmol/L NaH2PO4 緩沖液（pH 2.2）。

高導緩沖液（HCB）組成為： 20 mmol/L NaH2PO4（pH 2.2）-乙腈（80∶20， V/V）。

樣品基質(zhì)為： 2.4% （w/w）SDS、0.6% （w/w）正辛烷、6.6% （w/w）正丁醇、0.2 mmol/L 硼砂緩沖液（pH 7.8）、20%乙腈。

紫外檢測波長為280 nm，運行電壓為 Symbolm@@ 20 kV，溫度為20 ℃。endprint

2.4 LVSS-DypH-sweep MEEKC運行模式

圖1是LVSS-DypH-sweep的原理圖。毛細管先用含有膠束的緩沖液沖洗，然后在毛細管中注入低pH值的高導緩沖液（HCB），用于收集大體積進樣的樣品（圖1A）; 樣品溶在高pH值的樣品基質(zhì)中，分析物帶負電荷并且向檢測器方向遷移，在毛細管兩端加了合適的電壓后，電滲流（EOF）應(yīng)指向進口端（如圖1B），樣品區(qū)和HCB區(qū)的接觸界面附近產(chǎn)生一個pH動態(tài)連接區(qū)帶，在電滲和電泳的合力下，低pH值HCB區(qū)帶中的H+向負極方向（進口端）移動，與樣品區(qū)帶中的OH-發(fā)生中和作用，樣品區(qū)帶轉(zhuǎn)變成低導區(qū)域，分析物速度增加; 快速移動的分析物從堿性樣品區(qū)帶分離，并且被酸性HCB區(qū)帶質(zhì)子化變成中性，遷移速度接近于零，在pH連接區(qū)帶發(fā)生堆積產(chǎn)生富集效應(yīng)。在毛細管兩端換上膠束運行緩沖液，當膠束穿過樣品區(qū)帶時，樣品在膠束相中分配富集，并被膠束帶著向前運動。隨著分離的進行，樣品區(qū)帶不斷縮短，樣品濃度不斷濃縮，從而實現(xiàn)了二次富集（如圖1C）。富集完成后，按照MEEKC方法分離（如圖1D）。

3 結(jié)果與討論

3.1 SDS濃度的影響

表面活性劑SDS濃度對形成微乳液的穩(wěn)定性有重要影響。較低的表面活性劑濃度會減少分析時間，但同時也會降低界面張力，使得到的微乳體系不穩(wěn)定。當SDS濃度低于2.4%時，在反向富集的過程中會出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，堵塞毛細管; 當SDS濃度在2.4%～6.6%之間變化時，由圖2可知，隨著SDS濃度的增加，分析物的保留時間延長，分離度減弱。因此SDS的最佳濃度選擇2.4%。

3.2 緩沖液pH值和濃度對分離的影響

當緩沖液的pH<3.0時，能夠有效抑制電滲流。當緩沖液的在pH 1.8～3.0范圍內(nèi)變化時，pH值對各組分的分離度影響較小，但隨著pH值增大，遷移時間延長。因此確定緩沖液的pH=2.2。固定緩沖液的pH=2.2，考察了NaH2PO4 的濃度對于分析結(jié)果的影響。當NaH2PO4的濃度在10～50 mmol/L 范圍內(nèi)時，緩沖液濃度的增加對PAHs分離度的影響較小，但分析時間延長。故本實驗選用20 mmol/L NaH2PO4 緩沖液（pH 2.2）為運行液。

3.3 樣品液基質(zhì)組成及濃度

多環(huán)芳烴是強疏水性物質(zhì)，基質(zhì)需要采用脂溶性較強的溶液，為了讓大體積進樣的基質(zhì)能排出毛細管，需要將基質(zhì)調(diào)節(jié)成弱堿性，使電滲流方向指向入口端與樣品適度分開。經(jīng)過考察，采用2.4% （w/w）SDS-0.6% （w/w）正辛烷-6.6% （w/w）正丁醇-0.2 mmol/L 硼砂緩沖液（pH 7.8）-乙腈（80∶20， V/V）作為樣品液基質(zhì)。

3.4 進樣時間和進HCB時間優(yōu)化

動力學進樣的靈敏度受到毛細管管長的制約，在動態(tài)pH連接掃集方法中，動力學進樣的體積一般為管長的20%或22%^[17]。實驗考察了樣品進樣體積的限值（40～90 s/16 kPa），發(fā)現(xiàn)進樣時間過長，會導致堆積效率降低、峰展寬。

實驗表明，加入HCB區(qū)帶能夠克服峰展寬，堆積效率提高，當分析物進入到HCB區(qū)帶中時，由于它的高導低場使分析物遷移速度降低，產(chǎn)生堆積效應(yīng)。如圖3所示，未加入HCB，峰形有所展寬，峰頂部出現(xiàn)平臺峰; 而加入HCB后，峰形尖銳、靈敏度增加。

對HCB區(qū)帶的長度和進樣時間進行了優(yōu)化。當進HCB區(qū)帶的時間為20 s（16 kPa）時，進樣的體積（80 s，16 kPa）可以達到管長的50%左右，并且獲得了較高的檢測靈敏度。

3.5 方法學考察

圖4為6種PAHs的標準品的正向MEEKC電泳譜圖，圖3B為標準品的LVSS-DypH-sweep電泳譜圖。

表明利用反向MEEKC法分離6種物質(zhì)，分析時間變短、分離度增加，采用聯(lián)用方式富集后的靈敏度明顯提高。配制6種PAHs系列標準溶液，在最優(yōu)化條件下進行分離分析，以峰面積（y）對樣品濃度（x， mg/L）進行線性回歸，以3倍信噪比（S/N=3）計算出6種分析物的檢出限（LOD），見表1。

3.6 樣品測定和回收率實驗

選擇了洗面奶、爽膚水、乳液、潤膚霜、沐浴露、粉底液、洗發(fā)水、護發(fā)素等9種不同形態(tài)的市售及美容院專用化妝品，每種選擇4個品牌，在優(yōu)化條件下同時檢測上述6種PAHs，均未檢出分析物。考慮到樣品基質(zhì)對富集效果的影響，將樣品溶液用二氯甲烷和微乳緩沖液稀釋20倍后進行分析。將提取后的樣品平行取2份，其中1份測定其本底值，另1份添加一定質(zhì)量濃度的混合標準溶液，做回收實驗，圖5是某品牌化妝品乳液加標后的毛細管電泳富集譜圖。重復5次的測定結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可知，6種物質(zhì)的回收率均在 90.6%～95.9%之間，其RSD均小于5.1%。

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On-line Preconcentration for Sensitive Analysis of PAHs in

Cosmetics by Reversed Microemulsion Electrokinetic Chromatography

CHEN Xin， NI Xing-Jiong， ZHANG Jia-Yu， LIU Ying， CAO Yu-Hua*

（School of Chemical and Material Engineering， the Ministry of Education Key Laboratory of Food Colloid and Technology，

Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

Abstract A sensitive analytical method based on reversed microemulsion electrokinetic chromatography （MEEKC） combined with on-line preconcentration technique was developed for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in cosmetics. For six lipophilic PAHs analytes which are difficult to be separated under conventional conditions， three stacking techniques including large volume sample stacking （LVSS）， dynamic pH junction and sweeping （LVSS-DypH-sweep） were combined to realize the efficient preconcentration and separation. Under the optimum conditions， including the microemulsion buffer with the composition of 2.4%（w/w）SDS-0.6% （w/w） octane-6.6% （w/w）n-butyl alcohol-20 mmol/L NaH2PO4 （pH 2.2）， HCB injection time of 20 s （16 kPa） and sample injection time of 80 s （16 kPa）， good enrichment effect was reached with the enrichment factors ranged from 25 to 80， and the PAHs were analyzed successfully within 27 min. The developed method was used to analyze the PAHs in cosmetics. The recoveries ranged from 90.6% to 95.9%. The RSD values （n=5） were less than 5.1%.

Keywords Microemulsion electrokinetic chromatography; Large volume sample stacking; Dynamic pH junction; Sweeping; Polycyclic aromatic hydrocarbons

（Received 17 September 2014; accepted 16 October 2014）

This work was supported by the General Administration of Quality Supervision， Inspection and Quarantine of the People′s Republic of China（No.2010IK183）endprint