氣相色譜—質(zhì)譜法快速檢測(cè)出口蔬菜中16種保鮮劑殘留

周雪+曹淑瑞+李賢良+郗存顯+徐芬+陳志瓊

摘 要 采用分散固相萃?。≦uEChERS）前處理方法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）建立出口蔬菜中16種保鮮劑殘留量的快速檢測(cè)方法。以葉菜類、茄果類、豆類、瓜類和塊莖類出口蔬菜為原料，樣品經(jīng)乙腈提取，QuEChERS除雜凈化，用GC-MS外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。16種保鮮劑在0.02～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9990～0.9997，檢出限（LOD，S/N=3）在0.004～0.965 μg/kg范圍內(nèi)。以0.01， 0.02和1.0 mg/kg添加濃度水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，回收率為76.7%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%～10.6%。與國(guó)標(biāo)GB/T 19648-2006等方法相比，本方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn)，能滿足出口蔬菜中16種保鮮劑殘留的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞 分散固相萃取; 出口蔬菜; 保鮮劑; 氣相色譜-質(zhì)譜法

1 引 言

內(nèi)陸蔬菜出口長(zhǎng)距離運(yùn)輸易腐敗變質(zhì)^[1]，不規(guī)范使用或?yàn)E用蔬菜保鮮劑會(huì)導(dǎo)致保鮮劑超標(biāo)。蔬菜保鮮劑主要分為天然保鮮劑和化學(xué)保鮮劑，由于化學(xué)保鮮劑價(jià)格低廉且易于操作，故在蔬菜儲(chǔ)藏運(yùn)輸中應(yīng)用較廣^[2]?；瘜W(xué)保鮮劑殘留量過(guò)大， ?不僅會(huì)影響出口蔬菜的質(zhì)量，還可能嚴(yán)重影響消費(fèi)者健康，有些保鮮劑甚至可能導(dǎo)致癌癥及一些神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生[3， 4]。眾多的檢測(cè)項(xiàng)目和較長(zhǎng)的檢測(cè)周期不僅給新鮮蔬菜收購(gòu)、出口通關(guān)帶來(lái)不便，還導(dǎo)致蔬菜保鮮品質(zhì)下降。研發(fā)多種保鮮劑殘留同時(shí)、快速、高靈敏度的分析方法，對(duì)提升出口蔬菜中保鮮劑殘留的檢測(cè)水平和加大監(jiān)管力度起著重要作用。

常用的保鮮劑殘留檢測(cè)方法主要有免疫分析法^[5]、生物傳感器^[6]、液相色譜法^[7]、液相色譜-質(zhì)譜法^[8]、氣相色譜法（GC）^[9]和氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）^[10]等。其中，GC的分離效能高、分析速度快，質(zhì)譜則提供準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息，GC-MS已成為多種保鮮劑殘留分析最為有力的方法之一。謝建軍等^[11]采用GC-MS法對(duì)果蔬中嘧霉胺、百菌清、丙環(huán)唑、三唑酮等多種保鮮劑殘留同時(shí)檢測(cè)進(jìn)行了報(bào)道。崔淑華等^[12]應(yīng)用GC-MS法對(duì)果蔬中腈菌唑、丙環(huán)唑、三唑酮等保鮮劑在內(nèi)的193種農(nóng)藥殘留同時(shí)進(jìn)行了檢測(cè)。由于各種保鮮劑理化性質(zhì)的差異性，同時(shí)檢測(cè)多種保鮮劑殘留的樣品前處理方法需滿足較寬范圍的化合物，如直接對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或以固相萃取小柱進(jìn)行凈化，前者未能去除雜質(zhì)，干擾較多;后者耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于通關(guān)放行。分散固相萃取是近年發(fā)展起來(lái)的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)的快速樣品前處理技術(shù)， 該方法不僅能有效凈化樣品，還具有耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、使用溶劑少等優(yōu)點(diǎn)。

本研究對(duì)出口蔬菜中同時(shí)提取16種保鮮劑的溶劑進(jìn)行了篩選，同時(shí)考察了乙酸銨緩沖溶液的作用，優(yōu)化了分散固相萃取等凈化條件，充分利用了GC-MS分離效率高、靈敏度高、專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，建立了同時(shí)快速檢測(cè)出口蔬菜中16種保鮮劑殘留量的方法。本方法具有高的準(zhǔn)確度和精密度，可為出口蔬菜中保鮮劑殘留量的快速檢測(cè)提供技術(shù)支持。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

7890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）;BS224S型天平（德國(guó)Sartorius公司）;渦旋振蕩混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）;3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) Sigma公司）;4011 Digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）;系列Eppendorf移液器（可調(diào)范圍：10～100 μL，20～200 μL，10～1000 μL，1000～5000 μL，1～10 mL，德國(guó)Eppendorf公司）。

16種保鮮劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均≥99%，美國(guó)AccuStandard公司）;乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、甲苯（色譜純，美國(guó)Tedia公司）;PSA（乙二胺-N-丙基硅烷，粒度60μm）、ODS（十八烷基硅烷鍵合硅膠、C18，粒度60 μm）均購(gòu)于美國(guó)Agilent Technologies公司;C18固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、活性炭固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、NH2固相萃取柱（6 mL，0.50 g）、ENVI-CARB/LC-NH2固相萃取柱（6 mL，0.50 g）均購(gòu)于美國(guó)SUPELCO公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水;蔬菜均購(gòu)于本地超市。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.01 g于燒杯中，加入少量丙酮，待完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用丙酮定容，配制成1000 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液。移取各個(gè)單標(biāo)儲(chǔ)備液，配制成20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲(chǔ)備液均置于 Symbolm@@ 18 ℃避光保存。儲(chǔ)備液用丙酮逐級(jí)稀釋，配制成系列工作溶液。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

DB-5 MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;載氣為高純度氦氣，流速1.2 mL/min;不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL;進(jìn)樣口溫度250 ℃;柱溫程序：初溫70 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間 28 min。離子源：EI源，電離能量70 eV;離子源溫度：230 ℃;四級(jí)桿溫度：150 ℃;接口溫度：280 ℃;溶劑延遲：5 min。endprint

2.4 樣品前處理

稱取蔬菜勻漿10.0 g于50 mL螺旋蓋聚四氟乙烯離心管，加入10 mL乙腈、4 mL 2 mol/L 乙酸銨溶液，渦旋振蕩2 min，加入5.0 g NaCl，渦旋 1 min，5000 r/min離心3 min，取有機(jī)相。重復(fù)提取一次，合并有機(jī)相。取10 mL有機(jī)相于15 mL螺旋蓋聚四氟乙烯離心管中，加入100 mg PSA、150 mg ODS、500 mg 無(wú)水MgSO4，渦旋1 min，以5000 r/min離心3 min，取上清液于25 mL旋蒸瓶中，在低于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至凈干，用丙酮定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾至氣相進(jìn)樣瓶中，待GC-MS測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.1.1 提取劑的選擇 由于16種保鮮劑極性存在一定差異性，因此選用常用的丙酮（AC）、丙酮-乙酸乙酯（AC-EAC，1∶1， V/V）、正己烷-乙酸乙酯（Hex-EAC，1∶1， V/V）、乙腈（AN）分別進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以選取合適的提取溶劑。結(jié)果如圖1（未加入乙酸銨緩沖溶液調(diào)pH值）所示，乙腈的提取回收率相對(duì)較好，故實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取劑。

對(duì)羥基苯甲酸酯類保鮮劑顯弱酸性，調(diào)節(jié)溶液pH值，使組分處于分子狀態(tài)，易被有機(jī)溶劑萃取，基于上述原理，考慮加入乙酸銨緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值。文獻(xiàn)[13]報(bào)道，加入2 mol/L 乙酸銨緩沖溶液后，對(duì)羥基苯甲酸酯類保鮮劑的回收率增大，且對(duì)其它保鮮劑的回收率沒(méi)有影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)2 mol/L 乙酸銨溶液加入體積（0， 2， 4， 6和10 mL）進(jìn)行了考察，當(dāng)乙酸銨溶液的加入體積為4 mL時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸酯類保鮮劑的回收率最佳，故本實(shí)驗(yàn)在提取過(guò)程中加入4 mL 2 mol/L乙酸銨緩沖溶液。

3.1.2 凈化條件的選擇

在QuEChERS文獻(xiàn)報(bào)道中，主要使用PSA， ODS和GCB吸附劑[9， 11， 14， 15]對(duì)提取液進(jìn)行凈化，GCB雖然能夠有效去除色素，但也會(huì)使多酚類和其它極性化合物回收率過(guò)低，故擬選用PSA、ODS達(dá)到好的凈化和回收效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)確定吸附劑用量，以甘藍(lán)為基質(zhì)，各保鮮劑的添加水平均為0.05 mg/kg，當(dāng)ODS用量不變，PSA的用量分別為0， 50， 100， 150和200 mg時(shí)，凈化結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)PSA用量為100 mg時(shí)，16種保鮮劑的回收效果較好。

當(dāng)PSA用量為100 mg時(shí)，改變ODS 用量（0， 50， 100， 150和200 mg），各保鮮劑的回收率相差不大，故對(duì)各水平ODS凈化后的甘藍(lán)空白樣品譜圖進(jìn)行重疊分析，見(jiàn)圖3。根據(jù)質(zhì)譜信息，殘留量較多的雜質(zhì)分別是N， N′-二乙基草酰胺、苯胺、5-乙酯基氨基-8-甲氧基喹啉。由圖3可見(jiàn)，150 mg ODS對(duì)苯胺的凈化效果最好，原因可能有3個(gè)方面：（1）非極性相互作用：苯胺的母核苯基與非極性吸附劑ODS之間的作用力，這種作用力在極性溶劑乙腈中有較好的體現(xiàn)，也稱疏水作用;（2）ODS顆粒表面殘留的硅羥基會(huì)與極性化合物苯胺發(fā)生次級(jí)相互作用，即發(fā)生氫鍵作用;（3）硅羥基解離后會(huì)和堿性化合物苯胺發(fā)生離子相互作用。ODS對(duì)N， N′-二乙基草酰胺的凈化作用不好，N， N′-二乙基草酰胺極性很強(qiáng)，故不存在非極性相互作用，推測(cè)非極性相互作用起主導(dǎo)作用。50 mg ODS對(duì)5-乙酯基氨基-8-甲氧基喹啉凈化效果最好，喹啉的極性很小，非極性相互作用起主導(dǎo)作用。綜合考慮，ODS用量定為150 mg。

在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中，若濃縮時(shí)溶劑較少，通常采用氮?dú)獯蹈煞绞?。由于本?shí)驗(yàn)提取溶劑選用乙腈，采用氮?dú)獯蹈煞绞胶臅r(shí)較長(zhǎng)，故采用旋轉(zhuǎn)抽干模式進(jìn)行濃縮。實(shí)驗(yàn)表明，兩者的回收效果相當(dāng)，故采用旋轉(zhuǎn)抽干模式以提升實(shí)驗(yàn)效率。

3.2 與其它方法進(jìn)行對(duì)比

將本方法與GB/T 19648 2006^[14]、GC-MS聯(lián)用測(cè)定果蔬中6種防腐殺菌劑檢測(cè)方法 [16]以及EN 165662-2008^[15]進(jìn)行了比較。GB/T 19648 2006采用凈化方式，先經(jīng)C18固相萃取柱，再經(jīng)活性炭固相萃取柱和NH2固相萃取柱串聯(lián)柱凈化;而文獻(xiàn)[16]未經(jīng)過(guò)凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用國(guó)標(biāo)方法的凈化方式， 對(duì)羥基苯甲酸酯、聯(lián)苯醚的回收率不及本方法，且耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)效率低;文獻(xiàn)[16]所用時(shí)間少，回收率也相對(duì)較好，但雜質(zhì)多，對(duì)儀器的損傷很大，且會(huì)對(duì)回收率造成假陽(yáng)性。本方法采用了歐盟EN 165662-2008^[15]的QuEChERS凈化方法，但是在提取過(guò)程中加入了乙酸銨溶液，且采用ODS凈化，更利于16種保鮮劑的同時(shí)提取和凈化處理。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 線性關(guān)系、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢出限

用丙酮將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度為0.02～2.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在設(shè)定的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定。以目標(biāo)物定量離子的峰面積對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（mg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，16種保鮮劑在0.02～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍S/N計(jì)算16種保鮮劑的檢出限。通過(guò)儀器分析目標(biāo)物的質(zhì)譜圖并結(jié)合文獻(xiàn)，確定各化合物的特征離子。16種保鮮劑的保留時(shí)間、選擇離子、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)以及檢出限見(jiàn)表2。

3.4 方法的回收率與精密度

分別向甘藍(lán)、黃瓜、四季豆、茄子、胡蘿卜等多種蔬菜勻漿中添加不同濃度的16種保鮮劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為0.01，0.02和1.0 mg/kg，按2.4節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。以茄子為例，各保鮮劑的平均回收率在76.7%～120%范圍內(nèi);RSD在2.1%～10.6%范圍內(nèi)（表3）。endprint

3.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

從本地超市購(gòu)得甘藍(lán)、白花菜、藠頭及辣椒等蔬菜，按照本實(shí)驗(yàn)選擇的最優(yōu)條件進(jìn)行提取凈化和分析，結(jié)果見(jiàn)表4。雖然在部分蔬菜中檢出部分保鮮劑，但其含量均未超過(guò)國(guó)家規(guī)定的蔬菜保鮮劑最高殘留量。

結(jié)果表明， 本方法在提取溶劑中加入乙酸銨溶液，有利于對(duì)羥基苯甲酸酯的提取，用PSA、ODS進(jìn)行了QuEChERS凈化。與其它保鮮劑多殘留分析方法相比，本方法具有操作方法簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能為出口蔬菜的快速通關(guān)提供技術(shù)保障。

References

1 PanstrugaR， ?Schulze-Lefert P. Microbes and Infection， ?2003， ?5（5）： 429-437

2 ZHOU Xue， ?CAO Shu-Rui， ?LI Xian-Liang， ?XI Cun-Xian， ?XU Fen， ?CHEN Zhi-Qiong. Journal of Anhui Agri. Sci.， ? 2014， ?42（17）： 5614-5616

周 雪， 曹淑瑞， 李賢良， 郗存顯， 徐 芬， 陳志瓊. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， ?2014， ?42（17）： 5614-5616

3 Kirkhorn S R， ?Schenker M B. J. Agr. Safety Health， ? 2002， ?8（2）： 199-214

4 Costa L G， ?Cole T B， ?Jarvik G P， ?Furlong C E. Annu. Rev. Med.， ? 2003， （54）： 371-392

5 GUO Nai-Fei， ?YU Ji-Cheng， ?JI Shu-Juan. Science and Technology of Food Industry， ? 2010， ?（3）： 409-413

郭乃菲， 于基成， 紀(jì)淑娟. 食品工業(yè)科技， ?2010， ?（3）： 409-413

6 CesarinoI， ?Moraes F C， ?Lanza M R V. Food Chem.， ? 2012， ?135（3）： 873-879

7 ProusalisK P， ?Polygenis D A， ?Syrokou A， ?Lamari F N， ?Tsegenidis T. Anal. Bioanal. Chem.， ? 2004， ?379（3）： 458-463

8 ZHANG Hui， ?HU Mei， ?WANG Jun， ?ZHANG Xi-Qi， ?ZHU Jian-Hua. Food Chem.， ? 2009， ?30（2）： 180-184

張 卉， 胡 梅， 王 俊， 張喜琦， 祝建華. 食品科學(xué)， ?2009， ?30（2）： 180-184

9 ZHU Li-Ping， ?ZHU Tao， ?PAN Yu-Xiang， ?SUN Jun， ?DONG Jing. Chinese J. Anal. Chem.， ? 2008， ?36（7）： 999-1003

朱莉萍， 朱 濤， 潘玉香， 孫 軍， 董 靜. 分析化學(xué)， ?2008， ?36（7）： 999-1003

10 Cerbera M I， ?Medina C， ?Portolés T， ?Pitarch E. Anal. Bioanal. Chem.， ? 2010， ?397（3）： 2873-2891

11 XIE Jian-Jun， ?CHEN Jie， ?LI Ju， ?YUAN Zhen-Yu， ?XIE Yu-Shan. Journal of Food Safety and Quality， ? 2013， ?4（1）： 82-88

謝建軍， 陳 捷， 李 菊， 袁震宇， 謝玉珊. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)， ?2013， ?4（1）： 82-88

12 CUI Shu-Hua， ?CHEN Wei-Shuang， ?QIAN Jia-Liang， ?DUAN Hao， ?LIU Tong-Ying， ?ZHANG Li-Dong. Chinese Journal of Chromatography， ? 2013， ?9（31）： 885-893

崔淑華， 陳慰雙， 錢(qián)家亮， 段 浩， 劉同英， 張立東. 色譜， ?2013， ?9（31）： 885-893

13 CAO Shu-Rui， ?LIU Zhi-Yong， ?ZHANG Lei， ?LI Xian-Liang， ?WANG Guo-Min， ?TANG Bo-Bin， ?YUAN Ruo. Chinese J. Anal. Chem. ， ? 2012， ?40（4）： 529-533endprint

曹淑瑞， 劉治勇， 張 雷， 李賢良， 王國(guó)民， 唐柏斌， 袁 若. 分析化學(xué)， ?2012， ?40（4）： 529-533

14 GBT 19648-2006， ?Method for Determination of 500 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables-GC-MS Method. National Standards of the People′s Republic of China

水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留骨的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).GBT 19648-2006

15 EN 165662-2008， ?Foods of Plant Origin-Determination of Pesticide Residues Using GC-MS and/or LC-MS/MS Following Acetonitrile Extraction/Partitioning and Cleanup by Dispersive SPE-QuEChERS-Method. EUROPEAN STANDARD

16 JIN Zhi， ?LI Ming， ?YANG Tao， ?ZHAHG Huang-Tao. Xinjiang Agricultural Science， ?2010， ?47（8）： 1693-1696

靳 智， 李 明， 楊 濤， 張煌濤. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， ?2010， ?47（8）： 1693-1696

Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for Rapid Detection

of 16 Preservative Residues in Vegetables for Export

ZHOU Xue1， CAO Shu-Rui2， LI Xian-Liang2， XI Cun-Xian2， XU Fen2， CHEN Zhi-Qiong*1

1（College of Pharmacy， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

2（Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Chongqing 400020， China）

Abstract A rapid detection method of 16 preservative residues in vegetables for export was developed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） after pre-treatment method of dispersive solid phase extraction （SPE）. Samples including leafy， eggplant fruit， bean， melon and tuber vegetables were extracted with acetonitrile and detected by GC/MS with external standard method after being cleaned up with dispersive SPE. The results showed that the method had a good linearity over concentration range of 0.02-2.0 mg/L preservatives with correlation coefficients of 0.9990-0.9997. The limits of detection （LODs） were in the range of 0.004-0.965 μg/kg. The recoveries of the preservatives were in the range of 76.7%-120.0% at the spiked levels of 0.01， 0.02 and 1.00 mg/kg， and the relative standard deviations （RSDs） were in the range of 2.1%-10.6%. Compared with the GB/T 19648-2006， etc， the method is rapid， simple， highly sensitive， and can meet testing requirements of 16 preservative residues in vegetables for export.

Keywords Dispersive solid phase extraction; Vegetables; Preservative; Gas chromatography-mass spectrometry

（Received 24 July 2014; accepted 24 September 2014）endprint