超高效液相色譜法同時(shí)鑒定育發(fā)化妝品中17種植物提取物標(biāo)識(shí)成分

譚建華+李慧勇+席紹峰+郭長(zhǎng)虹+王繼才+熊小婷+冼燕萍+郭新東

摘 要 建立了同時(shí)鑒定育發(fā)化妝品中芍藥苷、羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸等17種植物提取物標(biāo)識(shí)成分的超高效液相分析方法。不同基質(zhì)的樣品經(jīng)80%甲醇溶液渦旋振蕩、超聲提取及NaCl法破乳后，提取液經(jīng)高速離心處理。選用Waters ACUITY UPLC CSH C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm），以甲醇/0.05% H3PO4為流動(dòng)相，梯度洗脫，然后采用二極陣列管檢測(cè)器（PDA）進(jìn)行測(cè)定?？疾炝朔椒ǖ撵`敏度、線性范圍、回收率、日內(nèi)和日間精密度。在本方法條件下，17種標(biāo)識(shí)功效成分在0.2～25 mg/L的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999;方法檢出限為0.3～1.5 mg/kg，方法定量限為1.0～4.0 mg/kg。樣品的回收率為93.5%～105.0%，日內(nèi)精密度（n=6）為0.4%～4.5%，日間精密度（n=6）為0.8%～4.6%。本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，已成功用于實(shí)際樣品中17種標(biāo)識(shí)功效成分的鑒定檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜;植物提取物標(biāo)識(shí)成分;育發(fā)化妝品

1 引 言

中草藥類植物提取液治療脫發(fā)是我國(guó)中醫(yī)傳統(tǒng)文化遺留的寶貴財(cái)富之一。許多研究證明，中草藥植物提取液外用對(duì)于治療脫發(fā)，特別是脂溢性脫發(fā)，療效顯著[1～4]。Seo等^[3]在C57BL/6雄性小鼠背上進(jìn)行生毛試驗(yàn)，證實(shí)側(cè)柏、首烏、浙貝和墨西哥辣椒4種植物提取液具有生發(fā)作用。然而，隨著各類新品牌的中草藥育發(fā)化妝品不斷出現(xiàn)，植物提取物概念正在不斷被許多企業(yè)濫用，虛假添加植物提取物或采用低廉、易得的植物提取物為原料，欺騙消費(fèi)者，甚至危害了消費(fèi)者的健康。因此，亟需建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，對(duì)植物提取物類育發(fā)化妝品進(jìn)行鑒定。

本研究以市場(chǎng)上育發(fā)化妝品最常使用以及可能使用的17種植物提取物為鑒定目標(biāo)，并依據(jù)中華人民共和國(guó)藥典第一部（2010版）^[5]選擇1～2種與各植物藥材及提取物相對(duì)應(yīng)的功效化合物為標(biāo)識(shí)成分，進(jìn)行鑒定研究。目前，關(guān)于植物提取物類功效化合物的檢測(cè)研究主要針對(duì)藥液^[6，7]、植物提取物^[8，9]和化妝品等[10～12]，然而對(duì)于育發(fā)化妝品中植物提取物標(biāo)識(shí)成分的鑒定方法研究尚未見報(bào)道。由于育發(fā)化妝品， 特別是育發(fā)洗發(fā)液的產(chǎn)品中， 含有大量的各類表面活性劑，給樣品前處理和儀器分析方法造成困難。本研究針對(duì)常見的育發(fā)洗發(fā)乳（膏）和精華液兩種基質(zhì)，通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件，比較不同的檢測(cè)方法（包括二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)法），建立一種簡(jiǎn)單、快速、高通量定性和定量鑒定育發(fā)化妝品中17種植物提取物標(biāo)識(shí)成分的方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

ACQUITYTM超高效液相色譜儀配二極陣列管檢測(cè)器和Waters XevoTM TQ MS 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）;Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（Beckman公司）;MS3 basic漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）;超純水系統(tǒng)（Milli-Q，美國(guó)Millipore公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，Spectrum公司）;甲酸、磷酸（分析純，上海安譜公司）。

17種標(biāo)準(zhǔn)品：芍藥苷（PF）、羥基紅花黃色素A（HYA）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（CG）、阿魏酸（FA）、甘草苷（LT）、何首烏苷（THS-GLU）、柚皮苷（NG）、蘆?。≧T）、補(bǔ)骨脂素（PL）、異補(bǔ)骨脂素（IPL）、槲皮苷（QR）、6-姜辣素（GR）、異歐前胡素（IIPR）、歐前胡素（IPR）、天然辣椒素（CSC）、芝麻素（SM）、丹參酮ⅡA（TSN） ，純度大于99.0%，均購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取17種標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1 g/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用80%甲醇溶液將單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成所需系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃避光保存。

2.3 樣品的制備與提取

準(zhǔn)確稱取0.5 g （精確至0.001 g）試樣，于10 mL具塞比色管中，用80%甲醇溶解并定容，加入1.0 g NaCl，置于漩渦振蕩器上混合，使樣品分散2 min，超聲提取5 min，取上清液10000 r/min離心5 min， 過(guò)濾后待測(cè)。

2.4 儀器分析條件

色譜柱：CSH C18（ 50 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters公司）;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣體積：5 μL;流速：0.3 mL/min; 流動(dòng)相A為0.05% H3PO4溶液，流動(dòng)B為甲醇。梯度洗脫：0～1 min，10% B，1～12 min，10%～100% B; 12～13 min，100% B; 13～16 min，100%～10% B。檢測(cè)波長(zhǎng)：210～400 nm，多波長(zhǎng)定量：PF （231 nm）， RT， QR（255 nm）， CG， PL， IPL，IPR， IIPR （247 nm）， HYA （399 nm）， LT， NG， GR， CSC， SM （281 nm）， FA， THS-GLU （321 nm）， TSN （268 nm）。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇

本研究選用不同濃度（V/V）的甲醇溶液（20%，30%，50%，80%，100%）為提取溶劑，以洗發(fā)膏為樣品基質(zhì)，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在提取油脂或增稠劑含量較高的洗發(fā)膏時(shí)，均會(huì)產(chǎn)生十分明顯的乳化現(xiàn)象，且提取液不均勻，導(dǎo)致大多數(shù)化合物的樣品加標(biāo)回收率小于50%，重現(xiàn)性差。因此，本研究考慮采用NaCl破乳法和亞鐵氰化鉀-醋酸鋅溶液沉淀法，對(duì)樣品溶液進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果表明，采用亞鐵氰化鉀-醋酸鋅溶液沉淀法，可能引起部分化合物吸附沉淀，導(dǎo)致回收率降低。采用NaCl破乳法，能得到較為澄清的提取液，在甲醇濃度高于80%時(shí)，所有化合物都能得到完全提取。但是，隨著甲醇濃度增高，NaCl破乳所析出的油脂類物質(zhì)減少，即樣品進(jìn)樣液中的雜質(zhì)過(guò)高，會(huì)在柱頭累積，進(jìn)而所造成進(jìn)樣溶劑效應(yīng)增強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選取80%甲醇溶液為提取溶劑。endprint

3.2 超高效液相色譜條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇

比較了4種不同填料色譜柱CSH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）， BEH C18（50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）， HSS T3（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm）， Shield RP18（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm） 的分離效果。結(jié)果表明，反相保留能力強(qiáng)的CSH C18和BEH C18色譜柱對(duì)于17種化合物的分離效果優(yōu)于親水色譜柱Shield RP18和HSS T3。由于CSH顆粒是在亞乙基橋雜化顆粒（BEH）基礎(chǔ)上，在其表面控制少量電荷，因此CSH C18對(duì)于可能帶電荷化合物的保留與BEH C18表現(xiàn)出不同的選擇性，可將17種化合物進(jìn)行有效分離（圖1）。因此，本實(shí)驗(yàn)選用CSH C18為色譜柱。

3.2.2 柱溫條件的選擇 比較了柱溫（22 ℃，25 ℃，30 ℃，40 ℃）對(duì)17種目標(biāo)化合物色譜分離的影響。結(jié)果表明，柱溫的變化對(duì)HYA/CG， THS-GLU/LT的色譜分離影響十分明顯。隨著柱溫升高，THS-GLU和LT的分離度下降，但HYH和CG色譜峰的分離度增加。比較4種柱溫條件下的分離效果，在柱溫為25 ℃時(shí)，17種目標(biāo)化合物的色譜峰均能達(dá)到基本分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選用25 ℃為柱溫條件。

3.2.3 檢測(cè)條件的選擇 比較了三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）和二極管陣列檢測(cè)器（UPLC-PDA）兩種檢測(cè)方法對(duì)育發(fā)化妝品中17種中草藥標(biāo)識(shí)成分的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明，UPLC-MS/MS雖然具有更高的靈敏度，但是由于17種化合物離子化方式不同，需采用不同的方法進(jìn)行采集分析。另外，由于育發(fā)化妝品特別是育發(fā)洗發(fā)乳類產(chǎn)品中常添加有高含量的表面活性劑（如十二烷基硫酸銨、月桂醇聚醚硫酸酯鈉等），造成目標(biāo)化合物嚴(yán)重的基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強(qiáng)作用， 且可能造成質(zhì)譜的持續(xù)污染。因此，考慮到育發(fā)化妝品基質(zhì)的特殊性，為了保證方法的簡(jiǎn)單、快速且高通量性，本研究采用UPLC-PDA檢測(cè)器， 根據(jù)各個(gè)化合物的紫外吸收特性，選用多波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)17種中草藥標(biāo)識(shí)成分進(jìn)行定量分析。

3.3 線性與方法檢出限

分別配制質(zhì)量濃度為0.20～25 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在本方法實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)17種中草藥標(biāo)識(shí)成分進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)其色譜峰面積積分值（Y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X， mg/L）響應(yīng)關(guān)系，得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，在0.20～25 mg/L范圍內(nèi)，17種化合物的線性關(guān)系良好，R2>0.999。本研究采用基質(zhì)樣品加標(biāo)方法，通過(guò)計(jì)算其標(biāo)樣的響應(yīng)與背景噪音的比值（S/N=3）確定方法檢出限，得到PF， LT， NG， RT， QR， GR， CSC和SM和TSN的方法檢出限為4.0 mg/kg，HYA， CG， FA和THS-GLU的方法檢出限為2.0 mg/kg，PL， IPL， IIPR和IPR的方法檢出限為1.0 mg/kg。

3.4 方法回收率和精密度

選用洗發(fā)膏和精華液兩種空白育發(fā)化妝品為加標(biāo)基質(zhì)，按本實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行低、中、高（4.0， 8.0， 20 mg/kg）添加水平的回收率與精密度實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，精華液樣品的回收率為93.5%～103.9%，日內(nèi)精密度（n=6）和日間精密度（n=6）分別為0.4%～3.4%和0.8%～3.6%;洗發(fā)膏樣品的回收率為94.0%～105.0%，日內(nèi)精密度（n=6）和日間精密度（n=6）分別為0.7%～4.5%和1.2%～4.6%。表明方法具有較高的回收率，準(zhǔn)確度和精密度良好。

3.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采集廣東地區(qū)市售的28份植物提取物類育發(fā)化妝品，涉及17個(gè)品牌，包括標(biāo)稱有育發(fā)、防脫、濃發(fā)、固發(fā)等功效的產(chǎn)品，典型色譜圖及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖2和表1。結(jié)果表明，標(biāo)識(shí)成分的檢出濃度范圍在小于方法檢出限（LOD）至211 mg/kg之間，大部分產(chǎn)品，特別是洗發(fā)產(chǎn)品中，植物提取物實(shí)際添加的含量較低，其標(biāo)識(shí)成分濃度甚至低于方法檢出限。目前市場(chǎng)上產(chǎn)品中添加植物提取物更偏重廣告效應(yīng)，而實(shí)際上植物提取物在育發(fā)化妝品中的功能效果有待值得進(jìn)一步研究和探討。

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Determination of 17 Characteristic Ingredients of Plant

Extracts in Hair Growth Cosmetics by Ultra High

Performance Liquid Chromatography

TAN Jian-Hua1，2， LI Hui-Yong1， XI Shao-Feng1，2， GUO Chang-Hong1，

WANG Ji-Cai1， XIONG Xiao-Ting1， XIAN Yan-Ping1， GUO Xin-Dong1

1（Guangzhou Products Quality Supervision and Testing Institute，

National Center for Quality Supervision and Testing of Cosmetics， Guangzhou 510110， China）

2（The College of Natural Resources and Environment of South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract A method was developed for the simultaneous determination of 17 characteristic ingredients of plant extracts， including paeoniflorin， hydroxysafflor yellow A， calycosin-7-glucoside ferulic acid， etc.， in hair growth cosmetics using ultra high performance liquid chromatography （UPLC）. Different cosmetic samples were extracted by ultrasonic-assisted extraction with the solvent of methanol/water （4∶1， V/V） solution. After demulsified by the addition of appropriate amount of NaCl and high speed centrifugation， the supernatant was transferred and analyzed with UPLC. The separation was conducted on a Waters reversed phase column of ACQUITY UPLC CSH C18 （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）， and the mobile phases were methanol and the solution of 0.05% phosphate in water. The detection was performed with a photodiode-array （PDA） detector. The linear range was 0.2-25 mg/L with correlation coefficients higher than 0.999. The limits of detection were within 0.3-1.5 mg/kg， and the limits of quantification were from 1.0 to 4.0 mg/kg. The average recoveries of 17 characteristic ingredients were within 93.5%-105.0%， with the intra-and inter-day precision （n=6） less than 4.6%. This method was simple， rapid， with good-repeatability， and had been applied to the analysis of real samples.

Keywords Ultra-high performance liquid chromatography; Characteristic ingredients of plant extracts; Hair growth cosmetics

（Received 16 June 2014; accepted 12 September 2014）endprint