■鄒林源 張鐵鷹 齊志國(guó) 杜家菊 王德山

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100029）

羽毛粗蛋白含量可達(dá)85%，其中胱氨酸含量最高達(dá)4.65%，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的含量次之，維生素B12以及微量元素的含量也很高[1-2]，且成本低廉，是較為廉價(jià)的一種蛋白質(zhì)資源。但羽毛蛋白主要以角蛋白為主，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難于被動(dòng)物消化利用。羽毛等天然角蛋白除肽鍵外，在分子內(nèi)和分子間存在二硫鍵、氫鍵、離子鍵(即鹽式鍵)、配位鍵和范德華力等多種鍵能，三維構(gòu)象高度交聯(lián)、穩(wěn)定。通常疏水基團(tuán)暴露在外，親水集團(tuán)隱藏在角蛋白內(nèi)部，疏水作用使角蛋白難溶于水。動(dòng)物胃蛋白酶和胰蛋白酶很難將其水解、消化[3]。一些觀點(diǎn)認(rèn)為角蛋白酶可獨(dú)自完成角蛋白的水解，也有一些觀點(diǎn)認(rèn)為角蛋白降解過(guò)程是由二硫鍵還原酶或還原劑啟動(dòng)，協(xié)助角蛋白酶來(lái)完成。有關(guān)角蛋白酶可單獨(dú)完成角蛋白徹底水解的研究報(bào)道較少[4-5]，大多角蛋白酶不能單獨(dú)完成角蛋白的徹底水解過(guò)程[6-8]。一些研究表明，加快二硫鍵的還原可影響角蛋白的降解效率[9-12]。生長(zhǎng)在羽毛介質(zhì)中的弧菌kr2可產(chǎn)生巰基說(shuō)明了存在二硫鍵被還原[13]。羽毛上Streptomyces pactum和Bacillus megaterium的生長(zhǎng)過(guò)程中也均發(fā)現(xiàn)存在二硫鍵還原反應(yīng)[14-15]。這說(shuō)明二硫鍵還原可能是微生物降解角蛋白的關(guān)鍵步驟。研究表明，角蛋白降解菌胞外具有還原二硫鍵的酶活性低于胞內(nèi)。谷胱甘肽還原酶屬于二硫鍵還原酶類(lèi)，具有二硫鍵還原酶活性。Serrano等（1984）[16]對(duì)藍(lán)藻菌中的谷胱甘肽還原酶進(jìn)行了分離純化，發(fā)現(xiàn)純化后的酶蛋白對(duì)氧化型谷胱甘肽的還原活力為249.2 U/mg，二硫鍵還原活性較高。本研究擬以具有較高二硫鍵還原活性的角蛋白降解菌Stenotrophomonas maltophilia為出發(fā)菌株，通過(guò)對(duì)其谷胱甘肽還原酶基因克隆和表達(dá)，獲得重組谷胱甘肽還原酶，并對(duì)其二硫鍵還原酶活性、酶學(xué)性質(zhì)和促進(jìn)角蛋白酶水解羽毛角蛋白的效果等進(jìn)行研究，探討Stenotrophomonas maltophilia胞內(nèi)液可明顯促進(jìn)胞外液水解角蛋白的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Stenotrophomonas maltophilia 10號(hào)菌為本實(shí)驗(yàn)室前期篩選保存野生菌株，大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)保存感受態(tài)。角蛋白酶K由本實(shí)驗(yàn)室從地衣芽孢桿菌CP-16中克隆表達(dá)純化得到[17]。

pMD19-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，pET-22b為本實(shí)驗(yàn)室保存。

DNA聚合酶（PrimeSTAR HS和LA Taq）、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；不同酶切位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自NEB公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；鎳柱純化蛋白試劑盒以及Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LB液體培養(yǎng)基及固體培養(yǎng)基參考王德山（2014）[17]的配制方法。

1.2.2 目的基因克隆

使用購(gòu)自北京博邁德公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Stenotrophomonas maltophilia的基因組。

在 Uniprot（http：//www.uniprot.org/）中搜集 Stenotrophomonas maltophilia中谷胱甘肽還原酶蛋白質(zhì)序列，根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)基因，正反向引物分別引入NcoI、XhoI酶切位點(diǎn)，引物如下：

正向引物：CATGCCATGGCAAGCACTGCACC

反向引物：CCGCTCGAGGCGCATCAGCAC

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性98℃ 1 min，變性94℃10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；總延伸72℃5 min。其中退火溫度可根據(jù)不同引物的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整。擴(kuò)增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

DNA酶切、連接和轉(zhuǎn)化等分子操作技術(shù)參照王德山（2014）及購(gòu)買(mǎi)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

將電泳驗(yàn)證后的PCR產(chǎn)物與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選和菌落PCR驗(yàn)證后將陽(yáng)性克隆測(cè)序。重組基因序列測(cè)定由北京博邁德公司完成。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并與目的基因MEGA比對(duì)檢測(cè)是否有突變基因。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

分別用NcoI、XhoI雙酶切pMD19-T-Glr及表達(dá)載體pET-22b，純化后于16℃連接過(guò)夜。將連接的重組質(zhì)粒pET-22b-Glr轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將篩選的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG（0.2 M，30℃，4 h）誘導(dǎo)后，收集菌體，超聲破碎（0.4 V電壓）過(guò)Ni2+柱純化。

1.2.4 重組蛋白SDS-PAGE分析

SDS-PAGE參照北京康為世紀(jì)公司試劑盒說(shuō)明書(shū)，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%。

1.2.5 二硫鍵還原酶活性和角蛋白酶活性測(cè)定

參照王德山（2014）的方法進(jìn)行檢測(cè)。蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法。

1.2.6 重組谷胱甘肽還原酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 最適酶促反應(yīng)pH值的測(cè)定

分別以不同pH值緩沖液作為二硫鍵還原酶活性測(cè)定中的緩沖體系，檢測(cè)酶的二硫鍵還原酶活性，將其中的最高酶活定義為100%，其他條件下的酶活以相對(duì)酶活表示，得到重組酶的最適反應(yīng)pH值。不同pH值緩沖液采用：檸檬酸-Na2HPO4緩沖液（pH值3.0～8.0），甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.2 M，pH值9～11.0）。

1.2.6.2 最適酶促反應(yīng)溫度測(cè)定

在不同溫度條件下（30～70℃，溫度間隔為5℃）檢測(cè)酶的二硫鍵還原酶活性，將其中的最高酶活定義為100%，其他條件下酶活以相對(duì)酶活表示，得到重組酶的最適反應(yīng)溫度。

1.2.7 重組酶對(duì)角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究

將重組酶稀釋為pH值8.0二硫鍵還原酶酶活為0.04 U/ml，測(cè)定在pH值8.0，55℃條件下不同組合時(shí)的角蛋白酶活性。各酶間組合見(jiàn)表1。

表1 酶組合中不同酶添加體積比例

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因克隆

以Stenotrophomonas maltophilia基因組DNA為模板，擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)為1 359 bp的基因序列。將測(cè)序結(jié)果與GenBanK已知序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明所得序列為目的基因全長(zhǎng)序列，該酶為。序列如下：

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的基因與質(zhì)粒分別經(jīng)NcoI、XhoI限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切后，連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)，PCR鑒定得到連接正確的轉(zhuǎn)化子。

2.3 目的基因在大腸桿菌中表達(dá)與鑒定

將鑒定正確的BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體，超聲破碎過(guò)Ni2+柱純化，檢測(cè)二硫鍵還原酶活性為1.85 U/mg。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，該重組酶分子量為48.8 kDa。

圖1 重組酶SDS-PAGE分析

2.4 重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 重組酶最適酶促反應(yīng)pH值

分別以不同pH緩沖液為測(cè)定酶活性中的緩沖體系，檢測(cè)二硫鍵還原酶活性，獲得酶促反應(yīng)最適pH值（見(jiàn)圖2）。由圖2可見(jiàn)，該重組酶最適反應(yīng)pH值為6.0。該酶除了pH值5～8間，其他pH值下均保留不足20%的活性，該酶適宜pH值范圍較窄，屬于偏中性的還原酶。

圖2 酶促反應(yīng)最適pH值

2.4.2 重組酶最適酶促反應(yīng)溫度

重組酶最適反應(yīng)溫度測(cè)定結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，該重組酶最適反應(yīng)溫度為40℃，在30～60℃之間該酶活性均能保持在50%以上，說(shuō)明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬，具有一定的耐溫性。

圖3 最適酶促反應(yīng)溫度

2.5 重組酶對(duì)角蛋白酶K降解羽毛角蛋白的研究

表2 羽毛角蛋白降解結(jié)果

由表2可知，單獨(dú)添加角蛋白酶K的羽毛角蛋白酶水解活性為65.6 U/ml，而單獨(dú)添加重組谷胱甘肽還原酶的羽毛角蛋白酶水解活性為36.5 U/ml。同時(shí)添加2種酶后羽毛角蛋白酶活性升至117.8 U/ml。這表明該酶可以明顯提高角蛋白酶降解羽毛角蛋白的活性，羽毛角蛋白活性比單獨(dú)添加2種酶提高了15%。由此可見(jiàn)，角蛋白降解菌Stenotrophomonas maltophilia胞內(nèi)液具有促進(jìn)胞外液水解角蛋白活性可能是其胞內(nèi)存在具有二硫鍵還原活性的酶蛋白。

3 討論

羽毛主要由角蛋白（91%）組成，其表面角質(zhì)層主要由高級(jí)脂肪酸和高級(jí)脂肪醇等脂類(lèi)物質(zhì)形成的動(dòng)物蠟組成（1%）[18-19]。這些脂質(zhì)與底層蛋白分子共價(jià)結(jié)合，疏水基外露，呈現(xiàn)出極強(qiáng)的疏水性。而與其他蛋白纖維相比，角蛋白半胱氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和絲氨酸含量高，其中約22%為疏水性，8.85%的半胱氨酸。角蛋白中半胱氨酸之間形成二硫鍵，從而使角蛋白的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定[20]，常見(jiàn)蛋白酶并不能將其徹底水解，如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等。然而，二硫鍵還原可顯著影響角蛋白的降解，打開(kāi)二硫鍵可能是水解角蛋白的關(guān)鍵步驟之一。

Yamamura等（2002）[21]從鹿皮毛中分離出角蛋白降解菌Stenotrophomonas sp.strain D-1可以分泌兩種胞外蛋白：水解蛋白和二硫鍵還原蛋白。其生化特性顯示這個(gè)蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶，二硫鍵還原蛋白可能屬于二硫鍵還原酶。這些酶的單體無(wú)角蛋白降解活性。然而，這兩種酶的混合物對(duì)角蛋白的降解力比單個(gè)蛋白酶提高了50多倍，比蛋白酶K組合提高了2倍。此外，二硫鍵還原酶可提高Bacillus subtilis蛋白酶水解角蛋白的活性17倍，促進(jìn)胰蛋白酶和蛋白酶K的水解活性也分別達(dá)6倍和2倍。Yamamura等（2002）角蛋白酶的活性也能被添加的β-ME、DTT和GSH等還原劑所激活，其可分別被提高約2.5倍、45倍和1.5倍，這表明還原性物質(zhì)在角蛋白降解中也具有重要的作用。Rahayu等（2012）分離出的芽孢桿菌（Bacillus sp.MTS）可以有效分解雞的羽毛。從該菌中純化了胞外角蛋白降解酶和二硫鍵還原酶并檢測(cè)了這些酶的酶學(xué)性質(zhì)以及他們的協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論與單體酶活性、蛋白酶K以及其他純化后角蛋白酶活性相比，純化角蛋白酶與純化二硫鍵還原酶組合水解角蛋白底物（羽毛和羊毛）的酶活性均有較大提高。利用掃描電子顯微鏡觀察了這2種酶在羽毛上具有相互協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆并表達(dá)了Stenotrophomonas malto-philia中谷胱甘肽還原酶基因，雖然該酶二硫鍵還原酶的比活力僅為1.85 U/mg，但其角蛋白酶水解羽毛的效率提高15%。這也進(jìn)一步證實(shí)了齊志國(guó)（2012）和Yamamura等（2002）報(bào)道的細(xì)菌胞內(nèi)液具有促進(jìn)胞外液角蛋白水解活性，且可能主要是一些具有二硫鍵還原活性的酶參與其中。本研究發(fā)現(xiàn)，該重組酶在30～60℃之間該酶的活性均能保持在50%以上，說(shuō)明該酶的溫度適應(yīng)范圍較寬，具備較好的工業(yè)應(yīng)用前景。但適宜pH值范圍較窄，需要后期通過(guò)基因改良等技術(shù)進(jìn)一步改善這一不足。

4 結(jié)論

以上研究進(jìn)一步說(shuō)明，微生物高效降解角蛋白的過(guò)程并非由角蛋白酶獨(dú)自完成，而是一個(gè)角蛋白酶和具有二硫鍵還原活性的多種酶共同參與的生物反應(yīng)過(guò)程。本研究結(jié)果一方面揭示了Stenotrophomonas maltophilia胞內(nèi)液具有促進(jìn)胞外液角蛋白水解活性的內(nèi)在機(jī)制，同時(shí)也為今后實(shí)現(xiàn)角蛋白生物酶解奠定了理論基礎(chǔ)。