【摘 要】目前，對于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的分離、培養(yǎng)，應(yīng)用廣泛的方法主要是全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心培養(yǎng)法.向骨髓液中加入紅細(xì)胞裂解液后用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，把紅細(xì)胞裂解掉，提高了分離純化BMSCs的效率.BMSCs的鑒定主要通過BMSCs表面抗原，但是，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)BMSCs的具有特異性的表面抗原標(biāo)志.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程中的研究越來越成為目前研究的熱點.

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

文章編號：20956894（2015）0412804

收稿日期：20150308；

接受日期：20150325

基金項目：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科技百萬工程（YKD2012KJBW003）

作者簡介：魯先闖.碩士在讀.研究方向：關(guān)節(jié)外科.Email：295739184 ＠qq.com

通訊作者：黃 健.Email：huangjian07316＠126.com

Bone marrow mesenchymal stem cells and research progress of them in tissue engineering

LU XianChuang 1，HUANG Jian 21Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010059，China； 2Second Affiliated Hospital，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010030，China

【Abstract】At present，the widely used methods for separation and culture of BMSCs are the whole bone marrow adherent culture method and density gradient centrifugation culture method.Whole bone marrow adherent culture method，with pyrolysis liquid of red blood cells added in bone marrow liquid，could crack red blood cells and thus improve the purification efficiency of BMSCs.BMSCs are indentified mainly by their surface antigens.However，no specific surface antigen marker has been found in BMSCs so far.Bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering are becoming the hot spot of current researches.

【Keywords】bone marrow mesenchymal stem cells；tissue engineering

0　引言

關(guān)節(jié)軟骨是覆蓋在關(guān)節(jié)表面可保護(hù)關(guān)節(jié)表面的彈性組織.根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，國內(nèi)40歲以上人群中，關(guān)節(jié)軟骨面二度以上磨損大約為五分之一，而60歲以上人群中，關(guān)節(jié)軟骨面二度以上磨損可達(dá)一半以上.正常的關(guān)節(jié)在關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)下，使人們能夠正常走路、爬樓梯、參加體育鍛煉、爬山、彎腰蹲起等，膝關(guān)節(jié)無疼痛感.關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)墊的作用.病灶的軟骨或軟骨損傷令人痛苦甚至致人殘疾，這是因為軟骨缺損的修復(fù)潛力內(nèi)在不足 ［1］.如同代謝失衡一樣，關(guān)節(jié)軟骨形成的整個活動，通過肥大和凋亡開始于細(xì)胞增殖，被確定為骨性關(guān)節(jié)炎（OA）進(jìn)展的一個重要的決定因素 ［2－3］.修復(fù)軟骨損傷的膝關(guān)節(jié)一直具有挑戰(zhàn)性，大面積軟骨損傷仍難以修復(fù).軟骨的損傷涉及到關(guān)節(jié)軟骨和潛在的軟骨下骨，關(guān)節(jié)軟骨或透明軟骨自身修復(fù)能力有限.因而，軟骨損傷治療的目標(biāo)是恢復(fù)透明軟骨和軟骨下骨的再生 ［4］.

1　研究背景

20世紀(jì)90年代，WHO曾將OA與心腦血管疾病及惡性腫瘤列為威脅中老年人健康的三大殺手.對于軟骨缺損，國內(nèi)外有很多研究和探索，但目前尚未攻克這一難題.

1.1 癥狀性治療

1.1.1 關(guān)節(jié)鏡清洗和清理術(shù) 該技術(shù)可以將游離體清洗出關(guān)節(jié)腔外；同時，也可治療由于外傷引起的關(guān)節(jié)軟骨破損，例如半月板的損傷、交叉韌帶的撕裂.雖然關(guān)節(jié)鏡清洗和清理術(shù)能夠暫時緩解疼痛，但是它治標(biāo)不治本，沒有解決根本問題，而且疼痛易復(fù)發(fā).

1.1.2 脛骨高位截骨術(shù) 雖然脛骨高位截骨術(shù)能夠使患者功能得到改善、使患者的關(guān)節(jié)疼痛得到緩解，但是它沒有達(dá)到根本治療關(guān)節(jié)軟骨磨損的目的.為了分析治療效果，把培養(yǎng)的BMSCs注射到關(guān)節(jié)內(nèi)并結(jié)合微骨折術(shù)和內(nèi)側(cè)開放楔形開口的脛骨高位截骨術(shù).把培養(yǎng)的BMSCs注射到關(guān)節(jié)內(nèi)，較單純脛骨高位截骨術(shù)、微骨折術(shù)，有效的提高了患者內(nèi)翻膝軟骨缺損的短期臨床效果和磁共振觀察軟骨組織（MOCART）的結(jié)果 ［5］.

1.1.3 人工關(guān)節(jié)置換術(shù) 人工關(guān)節(jié)置換術(shù)創(chuàng)傷較大，給患者帶來了巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且可能出現(xiàn)后遺癥，例如感染，假體松動等.

1.1.4 藥物治療 止疼藥物治療，例如西樂葆、吲哚美辛栓、ADSCs等，通過Koh等 ［6－8］的三項研究，他們用高濃度的ADSCs注射到髕骨下的脂肪墊中來治療膝OA.首先，他們在25個患者中做了一個病例對照研究，每名患者都接受了注射單一的ADSCs，隨后，繼續(xù)接受富血小板血漿治療，臨床結(jié)果令人滿意.在另一項研究中，與兩組病例研究（不是對照）類似的治療過程中，對于不同來源的患者使用ADSCs.所有的臨床結(jié)果和軟骨的MRI評分都顯著提高 ［7－8］.但是止疼藥物不能從根本上改變關(guān)節(jié)軟骨的缺損，而且止疼藥物也會帶來毒副作用；延緩關(guān)節(jié)軟骨退化的藥物，例如維固力，但是它只能延緩關(guān)節(jié)軟骨退化，而不能修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨，它只能作為中老年人的一種保健藥.

1.2 骨軟骨移植

1.2.1 自體移植 該方法供體來源有限，不能用于大范圍缺損修復(fù)，并且不能根據(jù)缺損區(qū)很好的塑型，存在缺損區(qū)無法滿意整合而造成關(guān)節(jié)退變等缺點.

1.2.2 異體移植 該方法不僅會產(chǎn)生排斥反應(yīng)、免疫反應(yīng)而且會傳播疾病.

1.3 采用源于骨髓的干細(xì)胞或者纖維母細(xì)胞治療但是修復(fù)缺損的組織不是透明軟骨而是纖維軟骨，纖維軟骨在生物學(xué)強度等功能方面均比透明軟骨差，不能達(dá)到關(guān)節(jié)軟骨功能，僅能暫時緩解癥狀，后期出現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎的可能性很大.

1.4 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞再生

1.4.1 骨膜移植 骨膜移植不僅產(chǎn)生的透明軟骨量少，而且再生軟骨性能差.

1.4.2 軟骨膜移植 軟骨膜移植會出現(xiàn)X型膠原而II型膠原較少.

1.4.3 自體軟骨細(xì)胞移植 軟骨細(xì)胞增殖能力有限，幾次傳代培養(yǎng)后，軟骨細(xì)胞逐漸去分化，不能繼續(xù)增殖.

1.5 外周干細(xì)胞 Saw等 ［9］做了包括50名患者的隊列研究，但使用的是外周干細(xì)胞.其研究結(jié)果很好，組織學(xué)評分和MRI上軟骨缺損修復(fù)的結(jié)果很好，但效果還需進(jìn)一步驗證.

1.6 組織工程 組織工程給軟骨缺損帶來了希望.組織工程就是利用BMSCs在生物支架的作用下，加入細(xì)胞因子，從而使BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，來修復(fù)缺損的軟骨.

2　BMSCs分離、培養(yǎng)的方法

BMSCs因其可塑性粘附能力、類似成纖維細(xì)胞的外表、表達(dá)特定的表面蛋白標(biāo)記物而得名，并因其多向分化的能力而被明確定義.在以前的研究中已經(jīng)廣泛應(yīng)用了兔子的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs （rBMSCs），經(jīng)典的例子是20世紀(jì)80年代Frieden stein等 ［10］在研究大鼠骨髓成骨髓細(xì)胞時，首次從骨髓基質(zhì)中分離、鑒定出一種非造血系成體多能干細(xì)胞，并在體外把這種細(xì)胞誘導(dǎo)分化為各種細(xì)胞，例如誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等，并把這種細(xì)胞稱之為BMSCs.體外BMSCs的提取和增殖的結(jié)果顯示，有兩個病人較其他人BMSCs的擴增速率低，這是由于人與人之間存在個體差異性 ［11］.由于在骨髓中BMSCs含量非常少，占單個核細(xì)胞的不到十萬分之一.然而組織工程需要的種子細(xì)胞的數(shù)量很大，從哺乳動物的骨髓中分離BMSCs存在缺點，使很多有關(guān)組織工程的實驗難以進(jìn)行.由于骨髓中BMSCs的量非常少，而且隨著年齡的增長，BMSCs的數(shù)量逐漸減少 ［12］；并且，生理狀態(tài)下20%為靜止期細(xì)胞 ［13］.所以，找到一種體外培養(yǎng)BMSCs并大量擴增的培養(yǎng)條件，為下一步研究BMSCs生物學(xué)特性及功能和誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞至關(guān)重要.因此，在體外獲得純度高、活力好、生物特性均一的BMSCs，對組織工程方面的研究及細(xì)胞的體內(nèi)、外實驗研究顯得極其關(guān)鍵.骨髓中不僅含有大量的造血干細(xì)胞，還含有一定量的BMSCs.就像多能造血干細(xì)胞具備強大的造血功能一樣，BMSCs也具備向軟骨細(xì)胞分化的能力，從而修復(fù)軟骨的缺損.但是，BMSCs不像造血干細(xì)胞那樣，其在骨髓中含量并不多.目前，分離培養(yǎng)BMSCs常用的方法包括全骨髓貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心培養(yǎng)法、流式細(xì)胞儀分離法和免疫磁珠法等 ［14］，后兩種方法雖可獲得較為純化的BMSCs，但由于BMSCs的自身特點，因其特別脆弱，在分選過程中，機械剪切力和高能激光可造成BMSCs的損傷，對其生物學(xué)特性、功能、活性、細(xì)胞形態(tài)等都會造成很大的影響.同時這兩種分離法的實驗要求較高，所用儀器及試劑昂貴，難以廣泛應(yīng)用；而前兩種方法是目前分離培養(yǎng)BMSCs最常用的方法，其中密度梯度離心法主要有Percoll分離液分離法和Ficoll分離液分離法，二者原理基本相同，都是將骨髓組織進(jìn)行密度分離，但分離液成分及各自工作液密度不同，F(xiàn)icoll分離液工作的密度為1.077 g/mL.實驗采用密度可調(diào)的Percoll分離液，離心3000 r/min，30 min后取骨髓細(xì)胞懸液中間的白膜層，所獲細(xì)胞種類較單一，降低了分離液細(xì)胞中雜質(zhì)細(xì)胞的比例，從而提高了BMSCs的純度.但是，骨髓液中含有較大量的紅細(xì)胞，近幾年來，國內(nèi)外有學(xué)者找到一種方法，來提高BMSCs的純度，他們向骨髓液中加入紅細(xì)胞裂解液，把紅細(xì)胞裂解掉，從而提高了分離純化BMSCs的效率，希望獲得純度較高、數(shù)量較多的BMSCs ［15］.這種方法建立在全骨髓貼壁培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，具備全骨髓貼壁培養(yǎng)法的全部優(yōu)點，但是，紅細(xì)胞裂解液法能夠獲得純度較高的BMSCs，而且比全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法得到的BMSCs量更多，同時并不影響其生物學(xué)活性，是一種簡便、可行的BMSCs分離方法.紅細(xì)胞裂解液法是在全骨髓貼壁培養(yǎng)法的基礎(chǔ)之上優(yōu)化而來，能夠較早的觀察到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)，而且紅細(xì)胞裂解液法能夠得到純度較高的BMSCs，同時能為BMSCs提供營養(yǎng).用紅細(xì)胞裂解液法來分離純化BMSCs的優(yōu)點如下：①用紅細(xì)胞裂解液法，骨髓液中含有各種促進(jìn)BMSCs的生長因子 ［15－16］.這是因為用紅細(xì)胞裂解液處理后，紅細(xì)胞裂解液能夠裂解紅細(xì)胞及血小板，從而把它們胞漿內(nèi)豐富的促BMSCs的生長因子釋放出來，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)BMSCs的成集落生長，為BMSCs提供更適宜的生長微環(huán)境，從而使BMSCs生長更快 ［17］.②用紅細(xì)胞裂解液法，可以增加BMSCs的濃度，提高BMSCs的增殖速度.由于骨髓液中其它細(xì)胞明顯減少，通過離心可以得到純度較高的含有BMSCs的骨髓液，從而明顯減少BMSCs的原代培養(yǎng)的時間，提高BMSCs的增殖速度.③能夠較早的促進(jìn)BMSCs的貼壁.研究顯示用紅細(xì)胞裂解液法，早期BMSCs的貼壁較高.這是因為使用紅細(xì)胞裂解液法，使影響B(tài)MSCs貼壁的紅細(xì)胞及血小板數(shù)量大量減少，為BMSCs貼壁留出更多的空間，以利于BMSCs的較早貼壁［18］.

3　BMSCs的鑒定

BMSCs的鑒定包括BMSCs的形態(tài)學(xué)特征、表面標(biāo)記蛋白、超微結(jié)構(gòu)和多向分化能力等.通過透射電子顯微鏡分析法，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析法、免疫組織化學(xué)染色法、流式細(xì)胞術(shù)、alamarBlue試驗、組織學(xué)染色和定量PCR分析法來觀察細(xì)胞、鑒定細(xì)胞.BMSCs來源于具有很強多向分化潛能的中胚層，從細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，BMSCs形態(tài)像成纖維細(xì)胞，貼壁生長為長梭型細(xì)胞，原代及傳代細(xì)胞之間的形態(tài)較均一.培養(yǎng)的BMSCs貼壁能力很強，其中，原代細(xì)胞出現(xiàn)集落生長，傳代細(xì)胞培養(yǎng)時，可以表現(xiàn)出較強的增殖性能.BMSCs的表面抗原標(biāo)志，具有非專一性的特征，它表達(dá)了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面抗原標(biāo)志.它的表面抗原SB10、SH2、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD120a和CD124等均呈陽性反應(yīng)，且陽性率不一；而對CD14、CD34、CD45等表面抗原均呈陰性反應(yīng).但是，到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)BMSCs的具有特異性的表面抗原標(biāo)志.

4　研究前景

大量的臨床試驗證實，一些報道顯示關(guān)于病人的癥狀預(yù)后有很好的結(jié)果.但是，自體軟骨細(xì)胞移植被證明對于小于45歲的患者比大于45歲的患者更有效 ［19］.人的BMSCs可以向軟骨細(xì)胞方向分化，有很大的潛力來修復(fù)軟骨缺損為OA和其它的關(guān)節(jié)疾病.然而，人們還一直不清楚軟骨形成的分子機制.在細(xì)胞培養(yǎng)中，我們跟隨著一個雙重穩(wěn)定的被氨基酸同位素（SILAC），通過向軟骨分化的第一步評估人BMSCs分泌蛋白質(zhì)的量.Kopen等 ［20］將提取較純的BMSCs接種在幼年小鼠的側(cè)腦室中，試驗顯示BMSCs在側(cè)腦室內(nèi)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，其中在海馬、嗅球、紋狀體等結(jié)構(gòu)中，均有BMSCs來源的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的高效表達(dá).這種現(xiàn)象提示我們可以用BMSCs來治療神經(jīng)退行性的疾病和中樞系統(tǒng)受損等疾病的可能.楊曉鳳等 ［21］的研究結(jié)果表明，經(jīng)動脈BMSCs移植可以治療股骨頭壞死.而其關(guān)鍵之一是種子細(xì)胞的開發(fā)，即如何能大量地獲取原代細(xì)胞用于修復(fù)骨、軟骨缺損.由于同種異體移植供體來源受限，而使其應(yīng)用受到很大的局限.成人的骨髓中BMSCs量很少，但是有高功能的不同方向分化的能力，能分化為特定的組織像骨、軟骨、肌肉、脂肪組織、韌帶、皮膚、骨髓基質(zhì)、肌腱和其他組織.在體內(nèi)移植，BMSCs也分泌多種生長因子、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和重要的生物活性大分子包括構(gòu)成再生微環(huán)境細(xì)胞來源的外來體.這個實驗通過小鼠模型描述了成人的BMSCs使軟骨形成或再生 ［22］.而在關(guān)節(jié)科，利用BMSCs來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的缺損的也已成為關(guān)節(jié)外科醫(yī)師研究的重中之重.

5　結(jié)語

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程中的研究越來越成為目前研究的熱點.紅細(xì)胞裂解液法，能夠成功分離出BMSCs，并得到有效的鑒定.運用組織工程學(xué)的原理，使BMSCs對軟骨缺損的修復(fù)成為了可能，給臨床醫(yī)生帶來了很大的希望.