劉金鳳，彭 杰，汪艷麗，劉如秀

·綜述與進展·

竇房結(jié)細胞起搏與超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道關(guān)系的研究進展

劉金鳳，彭 杰，汪艷麗，劉如秀

竇房結(jié)是正常心臟活動的起搏點，竇房結(jié)細胞的自律性決定心率的快慢，而竇房結(jié)細胞4期自動除極是其產(chǎn)生自律性的基礎(chǔ)，該過程是通過竇房結(jié)細胞膜上多種離子流的共同作用而實現(xiàn)的，其中超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道(HCN)及其產(chǎn)生的電流(If電流)在竇房結(jié)細胞起搏電活動中具有重要作用。本文探討竇房結(jié)細胞起搏與超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道的關(guān)系，為臨床治療病態(tài)竇房結(jié)綜合征等緩慢性心律失常提供新的方向。

竇房結(jié)細胞；超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道；起搏電流

竇房結(jié)(sino-atrial node，SAN)是正常心臟活動的起搏點，在心臟傳導系統(tǒng)中自律性最高，決定了心率的快慢，其病變直接表現(xiàn)為心電生理功能的異常。竇房結(jié)細胞(sino-atrialnode cells，SNC)是竇房結(jié)產(chǎn)生電生理活動的基礎(chǔ)，竇房結(jié)細胞起搏有多種離子通道及相應電流參與，其中超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channel，HCN)及其產(chǎn)生的電流(If)在竇房結(jié)細胞起搏電活動中起著重要作用。

1 竇房結(jié)與竇房結(jié)細胞起搏電生理

竇房結(jié)位于右房和上下腔靜脈的交界部位(界嵴)以及上下腔靜脈之間的區(qū)域，其生理功能主要是控制并維持心率在一個穩(wěn)定的水平。竇房結(jié)血供由竇房結(jié)動脈供應，該動脈55%～60%來自右冠狀動脈的右房前動脈供血，40%～45%來自左冠狀動脈回旋支的左房前動脈供血。竇房結(jié)內(nèi)結(jié)構(gòu)不均勻，結(jié)內(nèi)的心肌細胞由中心向周邊依次分布P細胞(pale/pacemaker細胞或起搏細胞)、T細胞(transitional細胞或過渡細胞)和心房肌細胞，其中P細胞在竇房結(jié)起搏活動中占有重要地位，P細胞自發(fā)性舒張期除極的特點形成竇房結(jié)的自律性；而從P細胞到心房肌細胞的傳導是通過T細胞完成的。

竇房結(jié)組織的非均一性使得竇房結(jié)中心與周邊細胞形態(tài)各異，其電生理特性也存在很大差異。對兔 SAN 的研究證明了從竇房結(jié)中央到心房邊緣的電生理特征的異質(zhì)性，表現(xiàn)在動作電位形態(tài)上的逐漸改變、最大舒張電位的降低、超射峰值的增加、上升速率的增加和起搏點位斜率的降低[1，2]?？赡苷怯捎诟]房結(jié)組織結(jié)構(gòu)的復雜性和功能的的異質(zhì)性，才保證了竇房結(jié)的正常工作。

隨著年齡的增長，竇房結(jié)結(jié)構(gòu)改變?nèi)缒z原沉積、腫脹、細胞的肥大和細胞外基質(zhì)的重塑，離子通道及細胞間連接的改變等，均可以導致竇房結(jié)起搏功能下降，從而使得病態(tài)竇房結(jié)綜合征(sick sinus syndrome，SSS)的發(fā)病率明顯上升[3，4]。老年人竇房結(jié)功能障礙的主要表現(xiàn)為竇房結(jié)恢復時間的延長和固有心率的降低，其電生理基礎(chǔ)是竇房結(jié)細胞舒張期去極化程度的降低和動作電位時程的延長[5]。此外，竇房結(jié)組織缺血缺氧也是竇房結(jié)心電生理功能異常的重要因素，如冠心病心肌缺血時，竇房結(jié)發(fā)生部分凋亡甚至壞死，使得心肌起搏細胞數(shù)量減少，進而出現(xiàn)竇房結(jié)結(jié)構(gòu)和功能的減退[6]。

竇房結(jié)的電生理功能歸功于竇房結(jié)起搏細胞的獨特電生理特性，以產(chǎn)生不同于周圍心房肌細胞的自發(fā)性動作電位，電沖動再通過心房，快速傳遞到房室結(jié)，最后在心室肌細胞引起興奮-收縮偶聯(lián)反應。在心臟的舒張期，心房肌及心室肌細胞不發(fā)生電沖動而維持在較高的超極化水平。但與之不同，自發(fā)搏動的竇房結(jié)細胞于舒張期存在緩慢的去極化過程，在動作電位的終點，細胞膜電位并不維持在一個更負的水平，而是以一定斜率緩慢地去極化，直到達到一次新沖動的閾電位，引發(fā)下一次的動作電位[7]。

竇房結(jié)細胞4期自動除極是竇房結(jié)產(chǎn)生自律性的基礎(chǔ)，因此是竇房結(jié)起搏活動的關(guān)鍵，該過程叫做舒張期去極化，是通過SNC細胞膜上多種離子流的共同作用而實現(xiàn)的。竇房結(jié)起搏機制從在體電生理到細胞電生理研究已經(jīng)歷經(jīng)40余年，但目前仍未明確。經(jīng)典的電生理理論認為，竇房結(jié)細胞4 期自動除極的主要機制是：超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子電流(起搏電流，簡稱If) 的激活、延遲整流性鉀電流(Ik)的失活以及L型鈣電流(ICa-L)和T型鈣電流(ICa-T) 的激活等[8]。竇房結(jié)細胞動作電位(電興奮)的產(chǎn)生與細胞膜上的各種離子通道直接相關(guān)，其中最重要的是與起搏電流有關(guān)的If通道，它決定最大舒張期電位，參與竇房結(jié)細胞舒張早期自動化除極后1/3 相，其分子基礎(chǔ)是超極化激活的環(huán)核苷酸門控(HCN) 通道，而Ik參與SNC動作電位舒張早期自動化除極前1/3相，電壓依賴性ICa-L參與舒張早期自動化除極中1/3相[9]。Schulze-Bahr等[10]報道了由于 HCN4 通道在第 573 個氨基酸殘基以后缺失的突變，而導致的 SAN 活動異常，HCN4是刺激交感神經(jīng)調(diào)節(jié)起搏點活動的主要通道。

2 竇房結(jié)細胞主要起搏離子流If電流

早在1980年，Brown等[11]在研究兔竇房結(jié)細胞時發(fā)現(xiàn)了一種超極化激活的離子電流，并將其命名為If(funny current)電流，又稱In電流，該電流在膜電位超極化時激活，后經(jīng)證實If / In 是參與竇房結(jié)起搏活動的重要起搏電流之一。

If電流由超極化激活陽離子通道的HCN 基因家族編碼，是竇房結(jié)細胞4 期自動除極的主要離子流，是細胞自律性的基礎(chǔ)。If電流是非特異性Na+、K+混合內(nèi)向電流，主要離子成分為Na+，有少量K+參與。在竇房結(jié)，If電流可以重復的使起搏點電位從-70 mV向-40 mV去極化，最終導致動作電位的發(fā)生[12]。

If電流呈電壓依賴性，但與其他大多數(shù)電壓依賴性通道在去極化激活不同，If在細胞膜超極化至 -50 mV～-70 mV 時激活，至-100 mV 時完全激活，翻轉(zhuǎn)電位為-2 mV±2 mV ，隨超極化的加強，If電流變大。該電流激活下存在兩種不同動力學成分，一種是小的瞬時內(nèi)向電流，它能在幾毫秒時間內(nèi)完全激活，一種是大的緩慢激活成分，其完全激活達到穩(wěn)定狀態(tài)時需要數(shù)百毫秒至數(shù)秒鐘的時間[13]。

If電流的第2個特性是環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)調(diào)控性。激素和神經(jīng)遞質(zhì)可以升高細胞內(nèi)的cAMP水平，使得HCN電流的半數(shù)激活電位移向較正電位并加快了通道的動力學特性[14]，因此交感神經(jīng)刺激和迷走張力通過cAMP 介導的If電流加快或減慢心率，If電流也被認為是機體應對腎上腺素刺激時竇性心率加速的重要機制。當β受體興奮，可通過Gas直接作用，增加If 的幅度，也可通過Gas/cAMP 的間接作用增加If 電流[15]。受體在與兒茶酚胺類物質(zhì)結(jié)合后激活cAMP，提高細胞內(nèi)cAMP 濃度，If 激活曲線的正向移動，超極化過程中的離子通道開放概率提高，產(chǎn)生一個更大的If 離子流來驅(qū)動舒張期去極化的過程，使去極化本身加速來提高自律性。相反，毒蕈堿樣乙酰膽堿受體興奮降低cAMP 的水平和減少If，使心率減緩。

3 If電流相關(guān)離子通道

1998年，Santoro等[16]和Ludwig等[17]首次發(fā)現(xiàn)了介導超極化激活陽離子電流的離子通道(HCN通道)，并在此后的兩年間陸續(xù)克隆出多種HCN通道，而編碼該通道的基因則被稱為HCN基因。

HCN基因的編碼產(chǎn)物HCN 通道均是由4個亞單位組裝而成的四聚體復合物，每個亞單位含有1個氨基端片段、6個跨膜片段(S1～S6)、1個C 末端環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cyclic nucleotide-binding domain，CNBD) 和1個羧基端片段，且各種HCN通道異構(gòu)型在跨膜片段和CNBD區(qū)是高度保守的，而在氨基末端和羧基末端的區(qū)域差異很大[18]。同時，HCN通道和電壓門控的K+通道及環(huán)腺苷酸門控通道在基因序列上有很高的同源性。

在對哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)HCN家族有4種基因亞型的表達：HCN1-4。其中在心臟中表達的亞型主要是HCN1、HCN2和HCN4，而竇房結(jié)中含量最高的亞型則是HCN4，兔竇房結(jié)HCN4可占HCN mRNA表達的4/5[19，20]?？偟膩碚f，HCN4 表達在傳導系統(tǒng)中具有自發(fā)活動的細胞上，能使起搏的頻率維持在一定水平以上并隨著機體不同的生理狀態(tài)而對頻率進行調(diào)整，而HCN2 基本表達在非自發(fā)活動的心肌細胞中，主要作用在于維持起搏節(jié)律的穩(wěn)定。通道激活動力學研究發(fā)現(xiàn)，HCN4激活最慢，但對cAMP反應性靈敏。組成HCN 通道的4個亞基可以相同或不同。Stieber 等[21]通過對部分心肌組織中2 種亞型對起搏通道的貢獻進行研究，認為起搏通道由單獨的HCN2或HCN4亞型組成，即起搏通道的同源構(gòu)成學說，但也有報道起搏通道由HCN2和HCN4共同組成，為起搏通道的異源構(gòu)成學說。

HCN4基因在竇房結(jié)起搏細胞的自發(fā)電活動中起著主要的作用，而且對心臟傳導系統(tǒng)的功能發(fā)育也起著非常重要的作用。HCN4 基因敲除小鼠模型研究證實HCN4 基因在動物胚胎發(fā)育過程中起至關(guān)重要的作用，HCN4 功能缺失小鼠在胚胎期就終止了生長發(fā)育[22]。Stieber 等[12]通過敲除小鼠HCN2、HCN4 基因及應用If 阻滯劑研究HCN 通道與竇房結(jié)心律失常的關(guān)系。實驗表明，HCN4 敲除小鼠心率明顯減慢，無心律不齊，無明顯的結(jié)構(gòu)異常，但收縮比正常小鼠減小40%，且cAMP 的應用不能扭轉(zhuǎn)減少。動作電位記錄提示HCN4 敲除小鼠僅能形成“原始”的動作電位而不能形成“成熟”的起搏電流。Yasui等[23]研究發(fā)現(xiàn)，早期的心室肌細胞可以產(chǎn)生自發(fā)搏動，這時心肌組織表達HCN4 及HCN1 亞型，到出生后1 d 的心肌細胞在大多數(shù)情況下已經(jīng)失去了自發(fā)搏動的能力，HCN2 成為了主要的亞型。隨著心室肌細胞中HCN mRNA 表達亞型的變化，總的mRNA 水平也下降了80%，同時If電流密度也相應減少?？傊琀CN4 是正常起搏電流產(chǎn)生的重要因素，也是基本心率的決定因素，其具有特征性的表達模式和緩慢門控作用，參與控制心臟起搏細胞的節(jié)律性活動。

HCN4通道的調(diào)控依賴于cAMP的門控機制為人們所熟知，它由20世紀90 年代早期意大利學者DiFrancesco 等[24]在竇房結(jié)細胞的膜片上記錄的電流實驗中首次揭示。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道是由cAMP 經(jīng)由PKA 介導的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化作用[25]，證實了PKA 介導的HCN通道磷酸化過程[26]。過去部分學者認為HCN 通道是由cAMP 結(jié)合到通道COOH 末端的環(huán)核苷酸結(jié)合域(CNBD)上從而激活通道，并不依賴磷酸化作用[27]。然而最新研究發(fā)現(xiàn)If 興奮調(diào)節(jié)中需要PKA的活性，PKA 能直接磷酸化HCN4，If被認為是竇房結(jié)細胞cAMP信號的末端效應和作用靶點[28，29]。目前HCN 通道由cAMP調(diào)節(jié)的分子機制正在進一步研究中。

4 超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道異常與心律失常

大量研究表明，HCN4通道異常與遺傳性心律失常的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，幾種嚴重的家族性心律失常如長QT 綜合征(LQTS)、短QT 綜合征(SQTS)、Brugada 綜合征、兒茶酚胺敏感性多源性室性心動過速(CPVT)、竇房結(jié)及房室結(jié)傳導系統(tǒng)紊亂、嬰幼兒及青少年猝死綜合征[30]已經(jīng)定義為離子通道病。這些心律失常涉及不同的HCN 基因突變，同時表現(xiàn)各異。

Ueda 等[31]分析了6 例竇房結(jié)功能障礙患者，3例進展性心臟傳導阻滯患者和14例自發(fā)性的心室顫動患者的HCN4基因，發(fā)現(xiàn)這些患者6個已知的離子通道出現(xiàn)陰性突變，導致HCN4 通道運輸障礙，出現(xiàn)膜表達下降和If 減低。Laish等[32]一項關(guān)于HCN4基因突變導致暈厥及心動過緩等臨床表現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，3個無血親關(guān)系的家系出現(xiàn)HCN4 基因突變，將此突變通道表達在爪蟾卵母細胞及HEK293 細胞上發(fā)現(xiàn)起搏電流功能異常及通道蛋白表達下降。Alig等[33]在小鼠中表達人HCN4 基因，發(fā)現(xiàn)人HCN4 基因突變導致If 對cAMP 敏感性下降，細胞舒張期除極速度減慢，心率明顯降低。總之，HCN4 相關(guān)離子通道病基因及功能研究說明，功能缺失突變所致HCN 電流抑制與心臟節(jié)律紊亂，尤其是心動過緩相關(guān)。

竇房結(jié)細胞HCN4 表達的異常與竇房結(jié)功能紊亂密切相關(guān)。某些心律失常的發(fā)生可能與竇房結(jié)急性缺血/再灌注損傷后，竇房結(jié)細胞HCN4基因表達減低，導致其主導的起搏電流If 異常有關(guān)。劉如秀等[34]研究甲醛滲透造成竇房結(jié)組織損傷對在體兔竇房結(jié)細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)竇房結(jié)損傷使竇房結(jié)細胞HCN4蛋白表達量下降，心率變慢，而益陽活血中藥可以上調(diào)HCN4蛋白表達從而提高心率。

綜上所述，生理狀態(tài)下HCN4通道相關(guān)電流If是產(chǎn)生心臟節(jié)律的重要因素，If 的失衡可能是各種心律失常發(fā)生的電生理基礎(chǔ)之一，而PKA信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)的HCN4通道蛋白磷酸化可能是關(guān)鍵的分子機制。通過上調(diào)起搏電流If，可提高竇房結(jié)細胞自律性，以緩解緩慢性心律失常。進一步研究重點是是如何增加HCN4基因的蛋白表達，提高If，最終增加心率，為臨床治療病竇綜合征等緩慢性心律失常提供新的方向。

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(本文編輯 郭懷印)

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2015-01-21)