湯桂麗

（中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430010）

基因芯片技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

湯桂麗

（中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430010）

基因芯片技術(shù)作為一種前沿生物技術(shù)，具有靈敏、快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域和臨床微生物檢驗(yàn)中都有廣泛的應(yīng)用。該文就基因芯片技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述。

基因芯片技術(shù)；臨床微生物；應(yīng)用；優(yōu)勢(shì)

基因芯片技術(shù)(gene chip technology，GCT)可以準(zhǔn)確、快速、及時(shí)地診斷感染性疾病的病原體[1-2]，對(duì)患者感染性疾病的臨床治療、預(yù)后具有重要價(jià)值[3-5]。傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)法(antibody detection method)、病原體培養(yǎng)法(pathogen culture method)等，操作煩瑣且所需周期較長(zhǎng)[6-7]，GCT的出現(xiàn)和成熟為臨床微生物的檢驗(yàn)提供了有力的技術(shù)條件。現(xiàn)就GCT在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了簡(jiǎn)要的綜述。

1 應(yīng)用背景及現(xiàn)狀

GCT是在20世紀(jì)80年代隨著“人類基因組計(jì)劃”的發(fā)展，90年代中期興起的一種新技術(shù)，可超高通量檢測(cè)基因表達(dá)[8]。其主要原理是將寡核苷酸探針或DNA以一定的順序和密度固定在載體(如硅片、玻片、NC膜、塑料片等)上，與核酸分子(用熒光染料或放射性核素標(biāo)記)進(jìn)行雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)檢測(cè)、分析，獲得樣品中大量的基因表達(dá)信息。GCT具有信息量大、快速、可進(jìn)行高通量篩選以及數(shù)據(jù)一致性好等優(yōu)勢(shì)[9]。目前，GCT已在生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域中顯示其發(fā)展?jié)摿?，并為臨床微生物檢驗(yàn)提供了良好的發(fā)展前景，已廣泛應(yīng)用于臨床微生物的基因組、基因變異性、基因多態(tài)性分析以及致病機(jī)制、感染后宿主機(jī)體基因表達(dá)的變化等方面的研究[10]。GCT的日趨完善，使臨床微生物檢驗(yàn)和抗生素敏感性測(cè)試可同步進(jìn)行，將使臨床微生物檢驗(yàn)更上一個(gè)臺(tái)階。

2 細(xì)菌檢測(cè)

2．1 分析臨床微生物基因組、基因變異性及多態(tài)性

基因芯片檢驗(yàn)病原菌的原理基于細(xì)菌的16S rRNA基因的高度保守性[11]。rRNA被稱為細(xì)菌的“活化石”，原因是該基因高度保守且進(jìn)化速度緩慢，可作為細(xì)菌生命的標(biāo)志[12]。rRNA基因包括23S(長(zhǎng)3．3kb)、16S(長(zhǎng)1．6kb)和5S(僅長(zhǎng)0．12kb)3個(gè)基因。目前，最常選用16S rRNA作細(xì)菌的分類和鑒定的基因，主要原因是16S rRNA基因長(zhǎng)度適中[13]，可作為細(xì)菌分類“金指標(biāo)”。16S rRNA基因與真核生物明顯不同的高度保守序列不少于9個(gè)[14]，為細(xì)菌所共有，目前基因庫(kù)幾乎包含所有已知細(xì)菌的16S rRNA基因的堿基序列。根據(jù)RNA易降解的特點(diǎn)，多采用檢測(cè)16S rRNA對(duì)應(yīng)染色體上的16S rDNA堿基序列序列，16S rDNA內(nèi)部結(jié)構(gòu)分為可變區(qū)與保守區(qū)(為細(xì)菌所共有，存在9～10個(gè)變異區(qū)(V1～V10)兩部分，兩部分交錯(cuò)排列，不同種屬間會(huì)有一定差異。對(duì)同一種細(xì)菌其基因組的同源性應(yīng)不小于70%，而對(duì)于16S rDNA，不同種屬的判定標(biāo)準(zhǔn)為差異在3個(gè)堿基以上，可用于細(xì)菌的分類和鑒別[15]。Han Bingbing等[16]采用GCT對(duì)4種細(xì)菌(大腸桿菌、傷寒桿菌、空腸彎曲菌、痢疾桿菌)進(jìn)行鑒別診斷，在設(shè)計(jì)這種鑒別診斷芯片時(shí)，以兩種靶基因(一是各菌種間的差異序列，二是同種細(xì)菌不同血清型所特有的標(biāo)志基因)固著于芯片表面，同時(shí)還含有細(xì)菌所共有的16S rDNA保守序列以確定為細(xì)菌感染的標(biāo)志。與傳統(tǒng)方法相比，該方法敏感度高、操作簡(jiǎn)單、診斷效率高、重復(fù)性好且節(jié)省時(shí)間[16]。

2．2 檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因

為了避免臨床無(wú)指征濫用抗菌藥物，需準(zhǔn)確及時(shí)地檢測(cè)病原菌的耐藥性，這樣可有效預(yù)防耐藥菌(drug-resistant bacteria，DRB)以及多重耐藥菌的產(chǎn)生[17-18]。傳統(tǒng)主要依靠培養(yǎng)法對(duì)細(xì)菌耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，普通細(xì)菌約需2 d可出結(jié)果，而對(duì)于生長(zhǎng)速度極慢的結(jié)核桿菌(N／med tuberculosis bacilli，NTB)則需3～4周時(shí)間。國(guó)外研究人員采用GCT檢測(cè)耐藥基因[19]，如Michael Wilson就曾使用此方法檢測(cè)到NTB中脂肪酸合成酶Ⅱ(Fatty acid synthaseⅡ，F(xiàn)ACⅡ)，efpA，fbpC，fadE23，fadE24及ahpC基因的改變與細(xì)菌耐藥性有關(guān)。美國(guó)（NARC）利用研制出的基因芯片來(lái)檢測(cè)NTB對(duì)利福平(rifampicin)、乙胺丁醇(ethambutol)及異煙肼(isoniazid)的耐藥性，檢出率分別為75%，70%及50%。采用GCT可同時(shí)檢測(cè)耐藥菌的多個(gè)耐藥基因，也可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)耐藥菌的多個(gè)耐藥基因[20]。找到耐藥菌的耐藥基因，不僅可將耐藥菌分成不同的亞型以便在臨床使用相應(yīng)的抗菌藥物，還可通過(guò)研究與藥物相對(duì)應(yīng)的特殊靶向基因，尋找能夠預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)藥物敏感性的基因，對(duì)新型抗菌藥物的設(shè)計(jì)也有幫助，可以制訂出個(gè)人藥物敏感譜，對(duì)臨床用藥以及新藥的合成均起指導(dǎo)作用，進(jìn)而改善治療效果。

3 病毒檢測(cè)

3．1 快速診斷流感病毒

對(duì)流感病毒(flu virus，F(xiàn)V)基因組的研究發(fā)現(xiàn)，其病毒膜蛋白M1由其RNA第7節(jié)段編碼，甲型FV M基因編碼252個(gè)氨基酸的M1蛋白，乙型FV M基因編碼248個(gè)氨基酸的M1蛋白，均非常保守，且兩型病毒M1蛋白間只有63個(gè)氨基酸相同，型特異性明顯，故M基因即可以診斷FV并對(duì)其分型，又不受抗原變異以及漂移的影響，可長(zhǎng)期使用，是流感病毒分子診斷的基礎(chǔ)[21]。

3．2 檢測(cè)肝炎病毒及其致病性相關(guān)研究

基因芯片可對(duì)肝炎病毒(hepatitis virus，HV)的分型、變異、突變及病毒核酸含量進(jìn)行高通量、平行檢測(cè)。臨床對(duì)獻(xiàn)血員的丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)篩查主要是通過(guò)檢測(cè)血中的HCV抗體、HBV抗原和抗體，而利用基因芯片將HCV及HBV的特異性基因片斷固著于芯片上，可直接對(duì)血液中兩種Virus的病原體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，為了提高檢測(cè)效率也可將多種熒光標(biāo)記樣本同時(shí)雜交于1張芯片上[22]。目前，在肝炎的抗病毒治療中產(chǎn)生的病毒耐藥突變，最典型者為拉米夫定(3TC)抗HBV治療中出現(xiàn)的YMDD變異。

3．3 檢測(cè)人類免疫缺陷病毒及感染后宿主機(jī)體基因的表達(dá)

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的檢測(cè)方法目前最常用的是血清學(xué) HIV抗體檢測(cè)，以 gpl60／gpl20，gp41，p31和p24這4種抗體均為陽(yáng)性作為確診HIV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]?；蛐酒瑢㈡湐U(kuò)增技術(shù)(PCR)與核酸分子雜交完美結(jié)合，通過(guò)對(duì)HIV基因組分析，將該病毒的高度保守序列作為鑒定指標(biāo)，可以直接對(duì)病毒病原體進(jìn)行檢測(cè)，在抗體產(chǎn)生之前即可作出早期診斷。

4 性傳播疾病檢測(cè)

基因芯片利用核酸分子堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，將多種病原體特異基因序列(探針)提取后以微陣列方式固定于芯片上[23]，使其與標(biāo)記的樣品核酸分子雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度，獲取樣品核酸分子的數(shù)量和序列信息，從而針對(duì)一份生物樣品，可同時(shí)檢測(cè)多種性傳播疾病的病原微生物。利用GCT檢測(cè)性傳播疾病的病原體相對(duì)目前被廣泛應(yīng)用的ELSA及PCR檢測(cè)技術(shù)，具有特異性、靈敏度高，假陽(yáng)性率和假陰性率低，操作快速、簡(jiǎn)便，自動(dòng)化程度高、結(jié)果客觀性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)的不足，如ELSA可能出現(xiàn)交叉免疫現(xiàn)象，PCR技術(shù)時(shí)常發(fā)生假陽(yáng)性或假陰性，從而避免了誤診現(xiàn)象的發(fā)生。診斷的病原體主要有梅毒、生殖器皰疹、淋病、巨細(xì)胞病毒感染癥、尖銳濕疣、非淋菌性陰道炎、外陰陰道白色念珠菌病等多種性傳播疾病[24]。

5 前景

近年來(lái)，GCT的應(yīng)用前景非常廣闊，但在技術(shù)和應(yīng)用上仍存在很多需要解決的問(wèn)題。首先，由于探針的雜交有一定的錯(cuò)配率，從而產(chǎn)生一定的背景。如何區(qū)分這種背景所造成的假陽(yáng)性和由于標(biāo)本中病原體拷貝數(shù)太低所造成的弱陽(yáng)性，是臨床微生物芯片面臨的主要挑戰(zhàn)。對(duì)臨床微生物來(lái)說(shuō)，多數(shù)都是原核生物，其共同特點(diǎn)是沒(méi)有polyA尾，因此無(wú)法像真核生物那樣通過(guò)polyA尾純化mRNA，并用反轉(zhuǎn)錄方法建立cDNA文庫(kù)。因此，如何方便、快捷地建立病原微生物的檢測(cè)探針是基因芯片亟待解決的瓶頸。其次，樣品的處理和應(yīng)用也面臨著很多干擾因素，對(duì)于常規(guī)病原微生物檢測(cè)芯片的應(yīng)用，需要提高芯片診斷的靈敏度和特異性。如何正確地對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的處理，使混雜因素降到最低，是日常工作者面臨的問(wèn)題。特別是蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)展緩慢，如何使各種蛋白質(zhì)穩(wěn)定地固定于芯片載體上，如何保持點(diǎn)樣蛋白的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性等問(wèn)題，尚有待進(jìn)一步解決。盡管存在一定的不足和缺憾，GCT與傳統(tǒng)微生物的檢測(cè)方法相比，仍具有檢測(cè)系統(tǒng)微型化、對(duì)樣品的需要量非常少、檢測(cè)效率高、能同時(shí)分析多種基因組或診斷用DNA序列的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還能檢測(cè)宿主細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)錄情況，有助于揭示發(fā)病機(jī)制及感染性疾病的診斷和治療，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

[1]Liu Y，Bowen NJ，Matyunina L，et al．Gene transfection enhanced by ultrasound exposure combined with drug treatment guided by gene chip analysis[J]．International Journal of Hyperthermia，2012，28(4)：349-361．

[2]Shiu-Ru Lin，Ming-Yii Huang，Ming-Sung Chang．A high-performance gene chip platform for detecting genetic markers from circulating tumor cells[J]．Biomarkers and Genomic Medicine，2013，5(1-2)：12-17．

[3]?terberg FW，Rizzi G，Donolato M，et al．On-chip detection of rolling circle amplified DNA Molecules from Bacillus globigii spores and Vibrio cholerae[J]．Small，2014，10(14)：2 877-2 882．

[4]黃德秋，廖燕飛，陳 燕，等．導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒基因分型的結(jié)果分析[J]．國(guó)際醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2014，13(21)：137-139．

[5]姚 雪，劉琪琦，趙 青，等．應(yīng)用可視化基因芯片技術(shù)檢測(cè)幽門螺桿菌感染個(gè)體化藥物治療相關(guān)基因[J]．中國(guó)生物工程雜志，2013，4(11)：97-105．

[6]Yi PF，Guo Y，Wang X，et al．Key genes and proteins involved in CTCM-reducing microvascular endothelial cell permeability induced by SLTIIv using gene chips and DIGE[J]．Cellular Immunology，2010，265(1)：9-14．

[7]He XL，Liu HQ，He B，et al．The use of human papillomavirus genotying kit based on gene chip technology for detecting and typing of human papillomavirus[J]．Journal of Sichuan University：Medical science edition，2013，44(4)：641-645．

[8]榮愛(ài)紅，趙蓬波，侯曉杰，等．基因芯片技術(shù)及其在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，12(11)：197-199．

[9]Chang L，Zhong S，Zhao N，et al．Application of Genetic Deafness Gene Chip for Detection of Gene Mutation of Deafness in Pregnant Women[J]．Journal of Otology，2014，9(2)：347-381．

[10]Li QL，Lü HB，Gou WJ．Study on the differentially expressed microRNA ofhuman retinal microvascular endothelial cells in high glucose environment by microRNA gene chip[J]．Journal of Chinese ophthalmology，2012，48(7)：604-609．

[11]田玉旺，許春偉，王東陽(yáng)，等．導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在女性生殖道人乳頭狀瘤病毒檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值[J]．解放軍醫(yī)藥雜志，2014，5(11)：92-96．

[12]郭斂容，蘇永進(jìn)，王 芬，等．導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在成人喉乳頭瘤病毒感染分型檢測(cè)中的臨床應(yīng)用[J]．中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2014，5(1)：34-36．

[13]李 明，鄧 芳，張 揚(yáng)，等．應(yīng)用Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒基因型[J]．安徽醫(yī)藥，2014，11(22)：77-80．

[14]Shi XC，Liu XQ，Xie XL，et al．Gene chip array for differentiation of mycobacterial species and detection of drug resistance[J]．Chinese Medical Journal，2012，125(18)：3 292-3 297．

[15]Lu Lu，Yang Gao，Miao Xu，et al．Gene expression profiles associated with osteoblasts differentiated from bone marrow stromal cells[J]．Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2014，7(5)：301-307．

[16]Han BB，Wang SJ，Zhang FY，et al．Influence of Aconiti Lateralis Radix Praeparata on asthenia cold syndrome rats with whole genome gene expression of liver by gene chip technique[J]．Chinese journal of traditional Chinese medicine，2012，37(4)：500-504．

[17]Wu CH，Chung FY，Chang JY，et al．Rapid detection of gene expression by a colorectal cancer Enzymatic Gene Chip Detection Kit[J]．Genomic Medicine，Biomarkers，and Health Sciences，2013，11(1)：24-28．

[18]梁艷梅．基因芯片聯(lián)合PCR檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒的意義[J]．中華全科醫(yī)學(xué)，2013，4(5)：129-130．

[19]葛天瑋，王 飛．尖銳濕疣患者腫瘤易感基因的基因芯片技術(shù)檢測(cè)[J]．中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志，2014，1(5)：19-22，57．

[20]崔 魴，孟江萍，向 瑜 ．流式熒光雜交技術(shù)和導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在 HPV分型檢測(cè)中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J]．臨床檢驗(yàn)雜志，2014，5(12)：79-81．

[21]Ting C，Jun A，Shun Z．Detection of the common resistance genes in Gram-negative bacteria using gene chip technology[J]．Indian journal of medical microbiology，2013，31(2)：142-147．

[22]Kakinoki S，Sakai Y，Takemura T，et al．Gene chip／PCR-array analysis of tissue response to 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine(MPC) polymer surfaces in a mouse subcutaneous transplantation system[J]．Journal of Biomaterials Science，Polymer Edition，2014，25(14-15)：1 658-1 672．

[23]Kang TY，Yang HR，Zhang J，et al．The studies of chlorogenic Acid antitumor mechanism by gene chip detection：the immune pathway gene expression[J]．Journal of analytical methods in chemistry，2013，5(1)：3 122-3 127．

[24]Junwei Hu，Shuang Dong，Qinqin Wang，et al．Differentially expressed genes identified by microarray analysis following oxymatrine treatment of hepatic stellate cell[J]．Journal of Biomedical Science and Engineering，2013，6(8)：49-57．

Application and Advantage of Gene Chip Technology in Clinical Microbiological Detection

Tang Guili
(Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region,Wuhan,Hubei,China 430010)

The gene chip technology as a kind of frontier biotechnology has the advantages of sensitivity,rapidness and high throughput, and has a wide range of applications in various fields of medicine and clinical microbiological detections．The application and superiority of the gene chip technology in the clinical microbiological detection are briefly reviewed．

gene chip technology;clinical microbiology;application;advantage

R446.61

A

1006-4931(2015)05-0092-03

2014-09-11)