林仙軍，羅成江，王 侃，張航俊(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州310020)

專題論述

色譜法在飼料檸檬酸檢測中的應(yīng)用

林仙軍，羅成江，王 侃，張航俊
(浙江省獸藥飼料監(jiān)察所，浙江杭州310020)

檸檬酸是有機酸中的第一大酸，又名拘櫞酸，分子式C6H8O7H2O，安全無毒，能被生物體直接代謝吸收［1］，作為飼料添加劑可提高飼料的適口性［2］，降低pH值，激活機體腸胃內(nèi)的消化酶，提高飼料轉(zhuǎn)化率，增強機體抗病力［3］，還可作為防霉劑和抗氧化劑保證飼料品質(zhì)［4］。

本文主要對飼料中檸檬酸的檢測方法作一簡要綜述，供參考。

1 高效液相色譜法(HPLC)

HPLC法是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器等組成，具有速度快、分辨率及靈敏度高、色譜柱可反復(fù)使用、樣品量少且易回收等優(yōu)點［5］，利用HPLC法對飼料中的檸檬酸進行測定，可以避免色素和雜質(zhì)影響，測定方法簡便，快速準確。

索德成等(2012)［6］利用HPLC法同時測定飼用酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸含量。采用Grom-Sil org acid柱(250 mm×2.1 mm，5μm)分析。流動相為pH值2.5磷酸水溶液;流速1.0 mL/min;檢測波長210 nm;柱溫30℃。在該色譜條件下，5種有機酸分離良好。平均回收率均大于85%，RSD小于10.0%。檢測結(jié)果表明該法操作簡便易行，準確可靠。鄭婷等(2009)［7］建立了測定飼料添加劑中主要有機酸-甲酸、乳酸、檸檬酸含量的HPLC分析法。色譜條件為Agilent ZORBAX SB-AQ 5μm(4.6 mm×250 mm)分析柱，流動相為0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH=2)∶乙腈=98∶2，流速0.8 mL/min，柱溫25℃，檢測波長210 nm，在200～4000 mg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，加標回收率98%～104%。謝明等(2004)［8］應(yīng)用反相液相色譜法同時分析測定飼料有機酸化劑中乙酸和檸檬酸的化學含量。結(jié)果表明，檸檬酸變異系數(shù)不超過3%，回收率92%～96%，測定具有較高的準確性和精確度。

HPLC法分析速度較快、靈敏度較高，但樣品預(yù)處理操作比較繁瑣，測定周期較長、成本較高、測定后需清除殘留樣品，若能與其他技術(shù)聯(lián)用，縮短檢測周期、降低測定成本，則在檢測飼料檸檬酸中將有更大進展。

2 離子色譜法(IC)

IC法是一種分析檸檬酸的有效方法，可按分離原理分為離子交換色譜法(IEC)和離子排斥色譜法(ICE)。IEC法的原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離［5］。

該法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸，在分離低分子有機酸方面，無需對樣品進行復(fù)雜的預(yù)處理，能很好分離和同時檢測多種有機酸，是分析低相對分子質(zhì)量有機酸的有效方法。ICE法分析有機酸主要有以下優(yōu)點:一是適合于含水基體;二是對強親水性物質(zhì)不會造成損失;三是只需簡單的樣品前處理，不需柱前衍生處理;四是有機酸分析幾乎不受無機陰離子干擾。

劉霞等(2009)［9］建立了同時測定飼料添加劑中甲酸、乳酸、檸檬酸及磷酸的IC法。樣品采用酸堿結(jié)合的預(yù)處理方法提取飼料添加劑中的4種有機酸。色譜條件為RFC-30KOH淋洗液發(fā)生器、AS11-HC離子色譜柱，抑制電導(dǎo)檢測。此法各種有機酸和無機酸線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)為0.9995～0.9998)，線性范圍為1～20 mg/L，回收率為98%～100%，分析方法快速簡便。

雖然IC法已應(yīng)用于飼料中檸檬酸的測定，但因淋洗液和柱填料的特殊性，對樣品中蛋白質(zhì)含量有嚴格限定，不適于復(fù)雜樣品分析，且柱子容量較小，進樣量不宜太多。因此，對于含有復(fù)雜成分的飼料，不適合用該法檢測檸檬酸含量。

3 氣相色譜法(GC)

GC法的原理是根據(jù)物質(zhì)的物理性質(zhì)不同，試樣中氣相和固定液液相間的分配系數(shù)不同，當汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運行時，組份就在其中的兩相間進行反復(fù)多次分配，由于固定相對各組份的吸附或溶解度不同，從而達到分離目的。

該法主要適用于氣體物質(zhì)或可在一定溫度下轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)，GC法與不同檢測器的聯(lián)用，大大提高了其檢測靈敏度，其中GC法和質(zhì)譜法聯(lián)用(GC-MS)已成為具有高分離能力、高靈敏度、高分析速度和高鑒定能力的分離檢測技術(shù)，是目前低分子有機酸檢測中最常用和最精密的方法。但因不易揮發(fā)或熱不穩(wěn)定酸類在進樣前需經(jīng)衍生化反應(yīng)，導(dǎo)致樣品前處理比較困難且費時，成為GC法檢測有機酸的瓶頸所在。

黃建立(2005)［10］建立了同時測定飼料添加劑中乳酸、檸檬酸的毛細管GC分析法。樣品添加內(nèi)標酒石酸后，用N，O一雙(三甲基硅烷)乙酰胺(BSA)硅烷化，經(jīng)SE-30毛細管柱色譜分離，氫火焰離子化檢測器檢測并對實際樣品進行分析。乳酸和檸檬酸的回收率分別為97.5%、97.3%。任清(2002)［11］建立了飼料添加劑中富馬酸、乳酸、檸檬酸同時測定的毛細管GC分析法。樣品添加內(nèi)標酒石酸后，用N，O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)硅烷化，經(jīng)SE-30毛細管柱色譜分離，氫火焰離子化檢測器檢測。富馬酸、乳酸和檸檬酸的回收率分別為97.4%、97.2%和96.8%。

飼料中檸檬酸的測定方法很多，但各有適用范圍與優(yōu)缺點。選擇合適的提取分離及分析測定方法，除需考慮所測飼料的結(jié)構(gòu)性質(zhì)外，還要考慮其成分對檸檬酸的干擾。

目前，色譜法作為基本分析方法，已經(jīng)成為測定飼料中檸檬酸的主要方法。檢測器、色譜柱聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)的發(fā)展，解決了傳統(tǒng)液相檢測器靈敏度和選擇性不夠的缺點，提供了可靠、精確的相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息，簡化了試驗步驟，節(jié)省了樣品準備時間和分析時間，因此是對飼料生產(chǎn)進行監(jiān)控的有效檢測手段之一。

［1］王浩，王文梅，許麗，等.檸檬酸的營養(yǎng)作用及其在斷奶仔豬飼養(yǎng)中的應(yīng)用［J］.動物營養(yǎng)學報，2012(6):1007 -1012.

［2］伍昭燕.日糧中添加檸檬酸對蛋雞生產(chǎn)性能的影響［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2011(1):72-74.

［3］薄濤.酸化劑的作用機理及其所受影響的因素［J］.當代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2007(12):12-14.

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［5］杜家菊，趙建飛.食品中檸檬酸檢測方法的研究進展［J］.山東理工大學學報(自然科學版)，2009(5):98 -103.

［6］索德成，李蘭，樊霞.飼用酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸的同步測定［J］.飼料工業(yè)，2012(21):60 -62.

［7］鄭婷，蔡玉興，劉霞，等.高效液相色譜法測定飼料添加劑中有機酸含量［J］.分析試驗室，2009(S2):230 -232.

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［10］黃建立.飼料添加劑中乳酸和檸檬酸的毛細管氣相色譜法測定［J］.福建分析測試，2005(4):2277-2279.

［11］任清.衍生化-毛細管氣相色譜法同時測定飼料添加劑中富馬酸、乳酸和檸檬酸［J］.分析化學，2002(3):304 -306.

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1005-7307(2015)05-0011-002

2014-07-11