王春蘭，李貴有，馬艷茹，金顯棟，王 喆，張繼才，亐開興*（.云南省種畜繁育推廣中心冷凍精液站，云南昆明650；.云南省草地動物科學(xué)研究院，云南昆明650）

提高種公牛冷凍精液品質(zhì)的綜合措施

王春蘭1，李貴有1，馬艷茹1，金顯棟2，王 喆2，張繼才2，亐開興2*
（1.云南省種畜繁育推廣中心冷凍精液站，云南昆明650212；2.云南省草地動物科學(xué)研究院，云南昆明650212）

【目的】冷凍精液的品質(zhì)直接關(guān)系到家畜品種改良工作的成效，通過改進和規(guī)范凍精制作操作規(guī)程，為家畜品種改良生產(chǎn)并提供高品質(zhì)的凍精?！痉椒ā拷Y(jié)合多年從事種公牛飼養(yǎng)管理、采精技術(shù)、凍精生產(chǎn)、保存與運輸?shù)榷喾矫娴墓ぷ鹘?jīng)驗，綜合了整體提高牛冷凍精液的質(zhì)量措施以及相應(yīng)的關(guān)鍵配套技術(shù)?！窘Y(jié)果】采用上述措施，本站生產(chǎn)的鮮精精子正常形態(tài)率達99%，凍精精子正常形態(tài)率為84%，凍精活力提高5%～10%，充分挖掘了種公牛的生產(chǎn)潛力?！窘Y(jié)論】通過采用本套技術(shù)措施，有效提高了種公牛凍精質(zhì)量，并且凍精產(chǎn)量增加，凍后品質(zhì)也有提高。

種公牛；采精技術(shù)；冷凍精液；飼養(yǎng)管理

隨著科技進步，畜牧業(yè)得以迅猛發(fā)展，畜牧業(yè)已成為我國農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟的重要產(chǎn)業(yè)，近些年來牛凍改技術(shù)得到大力推廣，凍精改良成為云南省牛品種改良的主導(dǎo)力量，牛冷凍精液的品質(zhì)好壞，決定著牛凍改的成效與進度，是牛品種改良持續(xù)發(fā)展的前提。生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的冷凍精液成為每個凍精站的首要任務(wù)，因此，如何提高種公牛冷凍精液的品質(zhì)也是凍精站的基本任務(wù)，有待不斷優(yōu)化冷凍精液生產(chǎn)中各個環(huán)節(jié)的有機協(xié)調(diào)發(fā)展，本文就種公牛飼養(yǎng)管理、采精技術(shù)、凍精生產(chǎn)、保存與運輸?shù)榷喾矫娴馁|(zhì)量控制措施以及相應(yīng)的關(guān)鍵配套技術(shù)做全面的闡述，以供公牛站同仁借鑒與交流。

1　加強種公牛飼養(yǎng)管理

1.1種公牛的飼養(yǎng)目標(biāo)

種公牛要求體質(zhì)健壯，肌肉發(fā)達，精力充沛，性欲旺盛，精液品質(zhì)好，精子耐凍性強。保持適宜的膘情和良好的體況，才能得到良好的精液品質(zhì)，種公牛不可過肥，也不可過瘦，無草腹，過肥的種公牛性欲較差，過瘦的種公牛精液品質(zhì)不佳。

1.2種公牛的飼養(yǎng)措施

1.2.1科學(xué)的日糧配制，合理的營養(yǎng)搭配 依據(jù)種公牛不同生長階段的營養(yǎng)需求，配制營養(yǎng)全價，適口性好，精、青、粗搭配適當(dāng)，滿足種公牛生長和采精對蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)及微量元素的需要量，采精公牛還必須根據(jù)精液質(zhì)量的好壞，及時調(diào)整飼料配方。

1.2.2精料的主要營養(yǎng)成分 成年種公牛的飼料必須保證充足的營養(yǎng)，一般混合精飼料中粗蛋白質(zhì)含量為14%～18%，能量為6.7～7.5M J/kg，粗纖維不高于4%，Ca、P比例為1～2∶1，食鹽1%。礦物質(zhì)、微量元素、維生素是動物生長不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，種公牛日糧中含有適宜的礦物質(zhì)、微量元素、維生素，對精液質(zhì)量的好壞起著關(guān)鍵性的作用。

1.2.3精飼料配制要求 飼料配制時間過長，容易造成氧化與變質(zhì)，飼料混合不均勻?qū)︼暳系臓I養(yǎng)成分有很大的影響，對種公牛健康有潛在的危害性，為了保證飼料質(zhì)量，一般10d左右配一次飼料比較合適。禁止飼喂霉變、有雜質(zhì)草料，以免影響種公牛的健康，減少疾病的發(fā)生，降低種公牛的淘汰率，延長使用年限。

適宜的營養(yǎng)成分對提高精液品質(zhì)起著關(guān)鍵作用，蛋白質(zhì)飼料屬于生理酸性飼料，過多的喂量會在體內(nèi)產(chǎn)生大量的有機酸，對精子的形成不利；青貯飼料屬于生理堿性飼料，本身含有大量的有機酸，多喂同樣會對精子的形成造成影響；維生素、食鹽和C a、P等礦物質(zhì)元素對促進消化機能、維持食欲和精液品質(zhì)影響很大，必須按照需要適量供給。

1.2.4飼喂量 干草和精料每頭每日喂量為種公牛體重的1%和0.4%～0.5%。

1.2.5飼喂方式 喂量根據(jù)不同季節(jié)溫度和牛體況的變化進行凋整，冬季提高能量飼料，夏季減少日糧能量及蛋白質(zhì)。本站從2014年5月采用全日糧混合機飼喂，臨喂前精、青、粗料加適量水用攪拌均勻，經(jīng)過攪拌后的混合日糧增強了種公牛適口性，每天定時定量分二次飼喂。

1.2.6供給充足干凈飲水 可采用自動飲水器供水，公牛自由飲水。

1.3種公牛的管理措施

1.3.1專人飼喂與管理 飼養(yǎng)員相對穩(wěn)定，不隨意換人；為使飼養(yǎng)員熟悉公牛的秉性，從幼齡開始飼養(yǎng)，并由飼養(yǎng)員親自調(diào)教公牛，養(yǎng)成溫順而活潑的習(xí)性。因種公牛記憶力強，防御反射強，所以飼養(yǎng)員平時不能逗弄、鞭打和訓(xùn)示，以免公牛記仇或養(yǎng)成惡癖；如果公牛不馴服時應(yīng)厲聲呵斥制止。在飼喂過程中，要仔細觀察牛群，發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時向主管領(lǐng)導(dǎo)或獸醫(yī)匯報，做到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早治療。

1.3.2適時的馴化和加強運動 10～12月齡后備種公牛必須穿戴鼻環(huán)，種公牛穿戴鼻環(huán)后應(yīng)經(jīng)常牽引訓(xùn)練，以養(yǎng)成溫順的性格。加強運動是保證種公牛肌肉、韌帶、骨骼健康，防止蹄變形和體態(tài)過肥，增強性欲，保證精液質(zhì)量的重要措施，因而必須保證每天有一定的運動量，除自由運動外，牽引運動不能少于1～2h。

1.3.3稱重與刷試 成年種公牛應(yīng)每月稱重一次，根據(jù)體重變化情況及時調(diào)整日糧配方，種公牛以保持中等膘情為宜。種公牛要每天刷試1～2次，種公牛站可以安裝淋浴設(shè)施或設(shè)置藥浴池以便牛體定期淋浴和驅(qū)蟲，保持牛體干凈衛(wèi)生。

1.3.4按摩和護理睪丸 每天必須用溫水清洗和按摩睪丸，獸醫(yī)定期對睪丸及陰囊進行檢查和護理。1.3.5護蹄 經(jīng)常觀察并檢查蹄趾有無異常，保持蹄壁和蹄叉的清潔。種公牛要經(jīng)常修蹄、護蹄，保證公牛四肢健康；每年春秋兩季各進行一次檢蹄、修蹄。

1.4疫病防治

在疫病防治上，堅持“防重于治，以防為主”的方針。按照本地動物疫控中心要求，對強制免疫和計劃免疫的疫病，根據(jù)實際在停采或節(jié)假日進行防疫和免疫接種，堅持每年春秋兩季防疫接種；平時做到封閉管理，謝絕非工作人員，外來人員進入生產(chǎn)區(qū)，飼養(yǎng)員每天經(jīng)過消毒通道后方可進入生產(chǎn)區(qū)上班，嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定，每天清掃圈舍，并每周消毒一次，工作通道每月消毒一次，以確保種公牛健康。

2　加強采精技術(shù)措施

采精前的充分準(zhǔn)備工作，正確掌握采精技術(shù)，合理采精頻率，是采得鮮精量多質(zhì)優(yōu)的保證，而采精技術(shù)的嫻熟度則直接影響新鮮精液品質(zhì)和數(shù)量。

2.1做好采精前的準(zhǔn)備

2.1.1器械消毒的準(zhǔn)備 潔凈的器械是保證精液不受外界污染的先決條件。玻璃器皿洗干凈后，置160℃干燥箱中干燥消毒；假陰道、三角套等橡膠器械清洗干凈，晾干后用75%酒精消毒；載玻片、冷凍架包裝用的紗布等物品紫外線下照射消毒0.5h，備用。

2.1.2稀釋液配制的準(zhǔn)備 篩選出最適宜的配方，采精前按配方準(zhǔn)確稱取所需試劑基礎(chǔ)液，置75℃水浴鍋中消毒30min；冷卻后加入卵黃15～20mL用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝髠溆谩；蚍湃?～5℃冰箱內(nèi)待用。使用前每100mL稀釋液加青鏈霉素各5～10萬IU攪勻，放置時間不宜超過24h。

2.1.3假陰道潤滑劑的準(zhǔn)備 白凡士林與液狀石蠟按1：1比例調(diào)制，用75℃水浴消毒。

2.1.4場地的準(zhǔn)備 采精場所應(yīng)保持安靜，地面保持清潔衛(wèi)生，無污染并鋪墊防滑設(shè)施，在每次使用前對采精架等設(shè)施進行安全檢查。

2.1.5臺牛的準(zhǔn)備 選擇健壯、性情溫順、無疫病的母?；蚬Ｗ雠_牛，并保定于采精架內(nèi)并將尾巴拴系，臺牛的外陰、臀部、肛門和公牛體表及包皮等在采精前應(yīng)沖洗干凈。

2.1.6采精人員的準(zhǔn)備 采精員挑選熱愛工作，熟悉每個采精公牛習(xí)性，業(yè)務(wù)熟練的人擔(dān)當(dāng)。采精時要身穿工作服，戴工作帽，穿長筒雨鞋，并剪短、磨光指甲，戴好一次性塑料手套。

2.1.7采精公牛的準(zhǔn)備 采精日將種公牛牽至采精棚，徹底清洗消毒種公牛下腹部及外陰，消毒液濃度符合標(biāo)準(zhǔn)要求，不準(zhǔn)擅自增減，每周剪一次陰毛，而后進入待采架拴系候采。

2.1.8假陰道的準(zhǔn)備 將準(zhǔn)備好的假陰道內(nèi)可提前注入溫水（38℃左右），并用消毒紗布將假陰道口包裹，放置于調(diào)整好的恒溫箱內(nèi)（44℃左右）待用。青年牛用光面內(nèi)胎，成年牛可用紋狀面內(nèi)胎，采精前假陰道內(nèi)溫度可能會下降；采精時內(nèi)胎溫度控制在38～40℃之間，根據(jù)不同的牛，溫度可做適當(dāng)調(diào)整，最高不得超過43℃。

采精前在假陰道內(nèi)胎的前三分之一段用涂抹棒均勻涂擦適量消毒過的潤滑劑，并從活塞孔打氣，使假陰道有適度的壓力（假陰道口呈三角形狀為宜）后即可進行采精。

2.2種公牛采精技術(shù)

1）為提高公牛的性欲可采取空爬、抑制爬跨、間隔爬跨、更換臺牛、更換地點、觀摩、引誘、被爬跨、按摩等措施使之有充分的性準(zhǔn)備，種公?？张?～3次，每次間隔5min，防止陰莖觸及臺牛，充分刺激公牛性欲，待公牛性欲旺盛時采精。

2）不同品種、個體及年齡應(yīng)使用不同類型假陰道，使采精器個體個性化，安裝好的假陰道只能使用一次，不得重復(fù)使用。

3）使用獨特潤滑劑配制以改進潤滑效果，方法是白凡士林與液狀石蠟按1：1比例調(diào)制，用75℃水浴消毒。

4）種公牛的采精方法：采精員右手持假陰道，站在公牛右后方，當(dāng)公牛起跳、前肢爬上臺牛時，迅速向前用左手托著公牛包皮，右手持假陰道與臺牛成40度角；假陰道入口斜向下方，左右手配合將公牛陰莖自然引入假陰道口內(nèi)（切勿用手捉拿陰莖或用假陰道去套陰莖），如果假陰道條件適宜，公牛往前一沖即完成射精動作，公牛隨即而下，此時采精員右手緊握假陰道，隨公牛陰莖而下，待公牛前肢落地時，緩慢地把假陰道脫出，并立即將假陰道入口斜向上方，打開活塞放氣，使精液盡快、充分地流入集精管內(nèi)，然后小心取下集精管，迅速轉(zhuǎn)移至精液處理室。

采精時飼養(yǎng)員與采精員要積極配合，采精員的動作要迅速而正確，膽大心細，注意人畜安全。每天采精結(jié)束后應(yīng)及時清掃場地用水沖洗干凈，假陰道等采精器械清洗干凈后應(yīng)盡快消毒。

2.2.5制定合理采精頻率：根據(jù)公牛體況改進采精頻率，通常成年公牛（24月齡以上）每周采精2d，每天采精2次；18～24月齡后備公牛，每周采精1d，每天采精2次；14月齡后備公牛開始采精，隔周采精1d，每天采1次。每天采精兩次的公牛，時間必須間隔30min以上。

3　凍精的制作

3.1制作前的準(zhǔn)備

凡是接觸精液的器皿應(yīng)放在30～35℃恒溫箱中，稀釋液放在34℃恒溫水浴箱水浴中備用。盛裝稀釋精液的稀釋管，應(yīng)做明顯標(biāo)記，以防不同公牛精液相互混淆。不同品種公牛的稀釋液按牛冷凍精液標(biāo)準(zhǔn)用不同的顏色予以區(qū)別。

3.2密度測定

采集的精液通過專用窗口傳遞入精液處理室，及時記錄牛號、采精量等有關(guān)數(shù)據(jù)。用精子密度儀、血球計數(shù)器或稱量的方法，準(zhǔn)確進行精液的密度測定，精子密度≥6×108個/mL。隨后計算出加稀釋液量、預(yù)計制作細管數(shù)等信息。要使測定值準(zhǔn)確，所用儀器需精確，操作必須正確。

3.3鏡檢

活力是判斷精液質(zhì)量的一項重要指標(biāo)，可取1滴精液樣品在37℃環(huán)境溫度中在相差顯微鏡鏡下檢查評定（用百分率表示），活力≥65%方為合格，可以使用。

3.4稀釋、封裝及平衡

稀釋操作原則：加稀釋液要緩慢、輕輕搖勻，稀釋液與精液等溫，加稀釋液量要準(zhǔn)確。使用一次稀釋方法將精液稀釋后，在低于20℃環(huán)境溫度下精液封裝，封裝后的細管精液放入不透光的塑料盒內(nèi)，每盒以盛放300支為宜，1頭牛的細管精液數(shù)量大可分放在二個塑料盒中，把盒放入4℃低溫柜中避光平衡3～4h。

封裝精液使用細管分裝一體機操作，這是一套在完成灌裝與封口后即刻進行噴墨印字的一體化設(shè)備，它的工作程序在盡可能不被外界污染的情況下完成細管精液的灌裝、封口和噴墨印字，這對提高產(chǎn)品的衛(wèi)生質(zhì)量極為有利。

4　冷凍

4.1細管精液上冷凍架

細管精液上架碼放時應(yīng)注意細管擺放的方向，把棉塞封口端靠操作者內(nèi)側(cè)，封口端遠離操作者外側(cè)，入冷凍箱時亦應(yīng)如此放置。每架上放有標(biāo)記物，便于識別牛號。同一架上只能放置1頭牛的細管精液。

4.2使用全自動冷凍儀對精液進行冷凍

冷凍儀是一個由計算機控制的全自動冷凍容器，可根據(jù)使用者的需要設(shè)置不同的冷凍溫度曲線，首先設(shè)置好牛冷凍精液最佳的冷凍溫度曲線，開啟液氮閥門把冷凍儀降溫至4℃，關(guān)閉風(fēng)扇電源，待風(fēng)扇完全停止后，把已排滿待凍細管精液的迅速放入冷凍儀，蓋嚴(yán)蓋子，按預(yù)先設(shè)定的最佳冷凍溫度自動完成冷凍過程。

4.3凍精收集

冷凍結(jié)束打開蓋子，細管冷凍精液按牛號分別投入盛滿液氮的不同容器中，細管的超聲波封口端在上，棉塞端向下，不可倒置，應(yīng)迅速浸泡在液氮中，這樣可避免細管棉塞端爆脫的發(fā)生，入臨時貯存庫。

5　凍精活力檢查

精液冷凍完成并在液氮中存放48h后進行質(zhì)量檢查，因為冷凍后精液需要在此環(huán)境中有一個穩(wěn)定過程，此時檢查的活力才是本批次凍精的真實反應(yīng)。用鑷子取一支冷凍后的細管精液放入事先調(diào)好的38～40℃溫水中輕搖晃動，待解凍后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用細管剪剪去超聲波封口端，滴小滴精液于載玻片上，即可用相差顯微鏡鏡檢，進行活力評定，肉牛活力≥35%，水?！?0%為合格凍精，鏡檢合格者方可進行包裝。

6　凍精包裝

檢驗合格的凍精在-140℃以下的環(huán)境中進行包裝，常規(guī)0.25mL微型細管用25支定量貯精管進行第一次包裝，然后再用標(biāo)記好品種、數(shù)量、生產(chǎn)日期等信息的紗布袋進行二次包裝，每袋包裝8個貯精管共計200支細管凍精。包裝過程中細管超聲波封口端一致朝外，包裝好的細管凍精入貯存庫。

7　凍精貯存與運輸

凍精貯存于液氮罐的液氮中，設(shè)專人保管，每周定時加一次液氮，應(yīng)經(jīng)常檢查液氮罐的狀況，發(fā)現(xiàn)液氮罐有問題要及時處理。包裝好的凍精由一個液氮罐轉(zhuǎn)換到另一個液氮罐時，在液氮罐外停留時間不得超過3s，取存凍精后要蓋好液氮罐塞，再取放管塞，要垂直輕拿輕放，不得用力過猛，防止液氮罐塞折斷或損壞。移動液氮罐時，不得在地上拖行，應(yīng)提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動。凍精運輸過程中要有專人負責(zé)，液氮罐不得橫倒、不得碰撞和強烈震動，保證凍精始終浸在液氮中。

8　注重質(zhì)檢工作，保證凍精質(zhì)量

牛冷凍精液生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中，嚴(yán)格按《牛冷凍精液國家標(biāo)準(zhǔn)》（GB4l43-2008）以及牛冷凍精液檢測技術(shù)規(guī)程執(zhí)行。凍精產(chǎn)品質(zhì)量由相對獨立部門技術(shù)人員負責(zé)檢測與監(jiān)督，每個月對每個公牛鮮精及凍精產(chǎn)品的質(zhì)量作一次檢驗，發(fā)現(xiàn)異常及時查找原因，及時解決。對重復(fù)檢驗，不合格凍精，堅決淘汰。凍精出站時再進行復(fù)檢，合格后方交付使用。

凍精質(zhì)量的控制按陸漢希等的程序進行：鮮精采集→鮮精檢查（不合格淘汰）→鮮精稀釋→鮮精平衡→制作凍精→凍精檢查（不合格淘汰）→凍精暫存→復(fù)檢（不合格淘汰）→貯存→凍精出站質(zhì)檢（不合格淘汰）→出站。凍精生產(chǎn)及銷售各環(huán)節(jié)中做好詳細記錄，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。

9　結(jié)語

凍精產(chǎn)量的增加和凍后品質(zhì)的提高，是一個綜合體現(xiàn)的過程。通過我們多年來的工作經(jīng)驗證明，采用上述措施，通常情況下本站種公牛鮮精精子正常形態(tài)率達99%，凍精精子正常形態(tài)率為84%，凍精活力提高了5%～10%，充分挖掘了種公牛的生產(chǎn)潛力。因此，科學(xué)的飼養(yǎng)管理，科學(xué)的采精技術(shù)，先進的生產(chǎn)工藝和嚴(yán)格的質(zhì)量管理是提高種公牛凍精質(zhì)量的關(guān)鍵措施。

Comprehensive Measures to Improve the Quality of Stock Bull Frozen Semen

WANG Chun-lan1，LI Gui-you1，Ma Yan-ru1，JIN Xian-dong2， WANG Zhe2，ZHANG Ji-cai2，QU Kai-xing2*
（1.Frozen Semen Station of Yunnan Livestock Breeding and Extending Center，Kunming，Yunnan，650212，China； 2.Yunnan Academy of Grassland and Animal Science，Kunming，Yunnan，650212，China）

【Objective】The quality of frozen semen directly affected the effects of livestock improvement. We can provide high-quality frozen semen for livestock improvement by improving and regulating the making rules of frozen semen.【Method】In this paper，the comprehensive strategies for improving the quality of stock bull frozen semen and the key counterpart techniques were illuminated，integrating the techniques of semen collection，frozen semen production，storage and transportation with feeding management for decades.【Result】With above measures，the rate of fresh semen sperms with normal morphology was 99％，the rate of frozen semen sperms with normal morphology was 84％，and it raised the vitality of frozen semen by 5％～10％，so the productive potential of stock bull was fully explored.【Conclusion】The quality of stock bull frozen semen was improved effectively by using these measures，and then，the production of frozen semen was increased，and the quality was improved after freezing too.

stock bull；semen collection；frozen semen；feeding management

S815.4

A

1001-9111（2015）

2015-06-20 修改日期：2015-07-10

云南省重大生物專項（2012Z A 024）、基礎(chǔ)研究計劃重大項目（2013F C 004）及面上項目（2012F B 199）；國家肉牛（牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（C A R S-38）。

王春蘭（1970-），女，漢族，云南江川人，畜牧師，從事種公牛管理與凍精改良技術(shù)推廣工作。E-mail：w-c l a n@ 163.com。

亐開興（1975-），男，云南祥云人，博士，副研究員，從事動物遺傳育種。E-mail：k a i x q u@y n bp.c n。