郝 雁

（山東省青島市立醫(yī)院（西院區(qū)）輸血科，山東 青島 266012）

血庫血液中輸血傳播病毒的檢測和基因序列分析

郝 雁

（山東省青島市立醫(yī)院（西院區(qū)）輸血科，山東 青島 266012）

目的 探討分析血庫血液中輸血傳播病毒的檢測結果及其基因序列的特征。方法選取某地血庫240例血液樣本，分離血漿，抽取DNA，采用巢式PCR進行檢測，然后選取檢測數(shù)據(jù)中陽性樣本3例進行DNA序列的測定，探討分析輸血傳播病毒的檢測結果以及其基因序列的特點。結果 該地血庫240例血液樣本中，經(jīng)PCR擴增后，共發(fā)現(xiàn)23例陽性者，輸血傳播病毒的陽性檢出率為9.7%，說明血庫中血源污染較為嚴重；對3例陽性樣本的DNA序列進行PCR產(chǎn)物直接測序發(fā)現(xiàn)，其同源性分別為94.5%、96.0%、67.8%，較低同源性的數(shù)據(jù)表明，輸血傳播病毒基因序列具有一定的差異性，體現(xiàn)了其基因的高度變異性。結論輸血傳播病毒的陽性率代表著血源的污染，研究其基因序列有利于對血庫中血源的管理；輸血傳播病毒的檢測結果及其基因序列的研究還有待進一步的發(fā)展，以便為人類某些疾病的發(fā)生與發(fā)展提供一定的依據(jù)。

輸血傳播病毒；基因序列；基因組；血庫

輸血傳播病毒（transfusion transmitted virus，TTV）擁有長3.8 kb左右的基因組，由非編碼區(qū)和編碼區(qū)兩個部分構成，其中較為保守的非編碼區(qū)序列是檢測輸血傳播病毒的重要區(qū)段［1］。輸血傳播病毒因其多樣性和高度的變異性而尚無明確的分型標準，但隨著研究的發(fā)展，研究者們針對發(fā)現(xiàn)的共30多種不一樣的基因型進行了劃分，后來主要總結為五大類基因群（G1～G5）［2］。輸血傳播病毒是能通過血液傳播的病毒之一，有研究表明［3］，輸血傳播病毒還可以通過胃腸道、母嬰、糞口等多種方式進行傳播，因此對其進行檢測以及對陽性者基因序列進行研究，有利于掌握和控制輸血傳播病毒的感染情況。本文特選取某地血庫240例血液樣本進行相關性的研究，探討分析血庫血液中輸血傳播病毒的檢測結果及其基因序列的特征，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1　材料與方法

1.1血液樣本來源：選取某地血庫240例血液樣本，所有血液樣本均由當?shù)亟诘墨I血志愿者提供。血液樣本中男女比例為1∶1，選取不區(qū)分年齡及體質(zhì)量等情況，且血液樣本的選擇具有一定的隨機性。

1.2病毒DNA的提?。簩?40例血液樣本分別進行離心，分離血漿，每一份樣本抽取200 μL的血清，在-80 ℃的條件下冰凍存，以便備用。取出凍存好的50 μL血清樣本置于適當容積的EP管中，加入準備好的病毒裂解液，進行10 min的沸水浴，然后離心取上清備用，離心參數(shù)設置分別為5 min、5000 r/min、4 ℃。

1.3巢式PCR檢測：根據(jù)保守的非編碼區(qū)序列區(qū)合成PCR引物，取10 μL備好的基因組樣本作為模板。25 μL反應體系，根據(jù)基因組特點選取引物，分別在94 ℃條件下反應5 min，94 ℃條件下反應30 s，60 ℃條件下反應30 s，72 ℃條件下反應30 s，共進行35個循環(huán)反應；再于72 ℃條件下反應10 min進行外循環(huán)的擴增延伸。內(nèi)循環(huán)擴增的反應條件、PCR體系等與外循環(huán)擴增的相同，內(nèi)循環(huán)擴增時，10 μL PCR產(chǎn)物所用引物均根據(jù)基因組特點選取。最終PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳分析（2%的瓊脂糖凝膠），連接載體擴大克隆后進行質(zhì)粒測序，序列通過導入NCBI進行比對后，確認是否為輸血傳播病毒。確認為輸血傳播病毒，則說明該血液樣本為陽性。

1.4DNA序列的測定：采用PE公司生產(chǎn)的自動測序儀，選取3例陽性樣本的DNA序列（PCR擴增陽性產(chǎn)物）進行直接測序。

2　結　果

該地血庫240例血液樣本中，經(jīng)PCR擴增后，共發(fā)現(xiàn)23例陽性者，輸血傳播病毒的陽性檢出率為9.7%，說明血庫中血源污染較為嚴重；對3例陽性樣本的DNA序列進行PCR產(chǎn)物直接測序發(fā)現(xiàn)，其同源性分別為94.5%、96.0%、67.8%，較低同源性的數(shù)據(jù)表明，輸血傳播病毒基因序列具有一定的差異性，體現(xiàn)了其基因的高度變異性。

3　討　論

輸血傳播病毒是具有高度變異性基因組的DNA病毒，無囊膜，且為單鏈［4］。本研究中，該地血庫240例血液樣本中，經(jīng)PCR擴增后，共發(fā)現(xiàn)23例陽性者，輸血傳播病毒的陽性檢出率為9.7%。與近些年的研究相比［5］，陽性檢出率相對要低，這可能與地區(qū)和人群的選擇有很大的關系。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝病患者中，輸血傳播病毒的陽性率要遠遠的高于健康人群的陽性檢出率。并且對同地區(qū)感染的基因型進行研究發(fā)現(xiàn)，占主導地位的基因型在一定時間內(nèi)并未發(fā)生變化，說明其基因型的變異率和差異性與地域或其他因素具有一定的聯(lián)系。對3例陽性樣本的DNA序列進行PCR產(chǎn)物直接測序，說明輸血傳播病毒基因組是具有高度變異性。各國家和地區(qū)均以G1或G2型輸血傳播病毒為主要類型，由于輸血傳播病毒具有較為廣泛的傳播途徑，因此發(fā)現(xiàn)的陽性率較高。并且不同年齡段內(nèi)，陽性率也有一定的差異，陽性率最高的中年人群，可能與其感染機會的增加、接觸范圍的增大等因素有關。

輸血傳播病毒由日本學者首次發(fā)現(xiàn)，其輸血傳播至今已經(jīng)得到了充分的證實，其這意味著血庫中血源感染輸血傳播病毒后進行輸血將對人類的健康產(chǎn)生不良的影響。雖然臨床上對感染是否致病，還沒有較為完善的依據(jù)，但已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，受血者感染輸血傳播病毒后有的會對機體造成一定的影響。

研究結果表明，TTV的傳播途徑主要包括以下幾個方面，如母嬰、性交、胃腸道血液傳播以及糞口等。該疾病對所有人群均易感，不管是患病人群還是正常人群，表現(xiàn)出明顯的全球化感染趨勢。然而在不同基因型的動物和人群中，TTV的流行情況卻不盡相同，這主要是因為TTV的基因組具有多樣性以及高度異質(zhì)性的特點，因此對人類TTV進行流行病學調(diào)查以及研究該疾病基因型別具有重要的研究價值和意義，同時也有利于對TTV的進化和親緣關系進行進一步的了解［6］。目前有研究者結果顯示，在亞洲等發(fā)展中國際以及歐美等發(fā)達國家，TTV的主要類型為G1型，而在韓國、巴西以及葡萄牙等國家，TTV的主要類型為G2型。流行病學研究結果表明，人群感染TTV主要以G1和G2類型為主，其原因可能是因為TTV具有廣泛的傳播途徑，導致獻血人員和正常人群均易受到感染，從而表現(xiàn)出較高的患病率，并且以中年人群居多。

綜上所述，輸血傳播病毒的陽性率代表著血源的污染，研究其基因序列有利于對血庫中血源的管理；輸血傳播病毒的檢測結果及其基因序列的研究還有待進一步的發(fā)展，以便為人類某些疾病的發(fā)生與發(fā)展提供一定的依據(jù)。

［1］李鳳蓮，杜麗新，劉丹，等.衡水市輸血科（血庫）輸血安全情況調(diào)查［J］.河北醫(yī)藥，2011，33（18）:2845-2846.

［2］劉暢，井申榮.人類輸血傳播病毒基因型別及流行率的研究進展［J］.中國生物制品學雜志，2012，25（5）:649-652.

［3］李秋嶺.永城市供血庫2004～2011年輸血前相關傳染病檢測結果報告［J］.中國實用醫(yī)藥，2012，7（34）:264-265.

［4］張洪兵.昆明市體檢人群輸血傳播病毒分子流行病學研究［D］.昆明:昆明理工大學，2014:6-93.

［5］李攀，張成，崔成成，等.昆明地區(qū)人輸血傳播病毒分子流行病學研究［J］.中國微生態(tài)學雜志，2014，26（10）:1127-1130.

［6］閆子國，赫兢，胡洪民，等.不同人群血清中抗輸血傳播病毒抗體的檢測［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，16（10）:1256-1257.

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1671-8194（2015）16-0122-02