心肌缺血／再灌注中RhoA的調(diào)控作用研究進(jìn)展

林溢煌，方蓮花，杜冠華

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

心肌缺血／再灌注中RhoA的調(diào)控作用研究進(jìn)展

林溢煌，方蓮花，杜冠華

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京市藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R-05；R322.11；R341；R542.202.2；R977.6

摘要：RhoA屬于小G蛋白R(shí)ho亞家族，在細(xì)胞的增殖、遷移、黏附及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。國(guó)內(nèi)外近期研究發(fā)現(xiàn)，一方面RhoA／ROCK通路可通過(guò)影響心肌能量代謝、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等在心肌缺血／再灌注中造成心肌損傷，另一方面，RhoA的激活對(duì)再灌注損傷也具有積極作用。該文對(duì)近年來(lái)RhoA在心肌缺血／再灌注中的調(diào)控作用及機(jī)制作一綜述，并探討其作為治療心肌缺血／再灌注損傷的藥物靶點(diǎn)的應(yīng)用前景，為研發(fā)心肌缺血／再灌注損傷治療藥物及其用藥策略提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：RhoA；心肌缺血／再灌注；ROCK；調(diào)控機(jī)制；藥物靶點(diǎn)；缺血性心臟病

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．004．html

缺血性心臟病是導(dǎo)致心臟病死亡的首要原因之一，占心臟病死亡人數(shù)的42%［1］。在急性心肌梗死后，使用血栓溶解治療法或者直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療而產(chǎn)生的早期心肌／再灌注是減小心肌梗死面積和提升臨床治療效果的有效策略。再灌注期間，持續(xù)的缺血使心肌損傷進(jìn)一步惡化，因此產(chǎn)生再灌注損傷［2］。心肌缺血／再灌注損傷（myocardial ischemia／reperfusion injury，MIRI）可導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死、凋亡、心律失常和其他心臟功能障礙。心肌缺血／再灌注的病理生理過(guò)程涉及許多因素，機(jī)制十分復(fù)雜，主要有心肌功能紊亂、能量代謝失常、大量自由基的合成、胞內(nèi)鈣離子超載、血流動(dòng)力學(xué)的改變、炎癥反應(yīng)的發(fā)生、嗜中性粒細(xì)胞滲透以及血管內(nèi)皮功能紊亂等［1，3］。

Rho家族是一類小G蛋白家族，具有GTP酶活性。目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)Rho蛋白已有23個(gè)，包括RhoA、Cdc42、Rac1等。Rho蛋白被認(rèn)為是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子已

有20年之久，在細(xì)胞分裂、存活、遷移及黏附等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。小G蛋白是G蛋白的一種，其共同特點(diǎn)是當(dāng)結(jié)合了三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）時(shí)即成為活化形式，這時(shí)可作用于下游分子使之活化，而當(dāng)GTP水解成為二磷酸鳥(niǎo)苷（GDP）時(shí)則恢復(fù)到非活化狀態(tài)，在多種細(xì)胞活動(dòng)中具有分子開(kāi)關(guān)作用［4－5］。

在眾多的Rho蛋白中，研究最多的是RhoA。最初RhoA被認(rèn)定為能有效調(diào)控細(xì)胞遷移的細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)分子。隨后大量實(shí)驗(yàn)研究表明，RhoA具有的影響力并不局限于在細(xì)胞遷移中調(diào)節(jié)肌動(dòng)球蛋白收縮性，而是具有更廣泛的其他功能，可作用于細(xì)胞生長(zhǎng)中的基因表達(dá)，炎癥反應(yīng)中的內(nèi)皮屏障紊亂，形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生時(shí)上皮細(xì)胞連接的調(diào)控以及吞噬作用中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。RhoA信號(hào)通路可通過(guò)多種細(xì)胞表面受體被上游分子激活，并通過(guò)已知的28個(gè)下游靶點(diǎn)調(diào)控靶細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能［6］。大量的研究表明，適當(dāng)抑制或激活RhoA信號(hào)通路在MIRI中具有心肌保護(hù)作用，本文將對(duì)RhoA在MIRI中的調(diào)控作用及機(jī)制進(jìn)行綜述。

1　抑制RhoA／ROCK通路產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用及調(diào)控機(jī)制

RhoA作用于下游分子Rho相關(guān)蛋白激酶（Rho associat-ed protein kinase，ROCK），是一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，它是小G蛋白R(shí)ho的下游作用底物［7］。ROCK本身可以被Rho、鞘氨醇磷脂酰膽堿（sphingosylphorylcholine，SPC）、花生四烯酸、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等多個(gè)上游分子所活化，而Rho蛋白是其最主要、最直接的上游刺激信號(hào)。在許多以細(xì)胞活性為中心的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，ROCK發(fā)揮著決定性的作用［5］。

RhoA／ROCK信號(hào)通路在MIRI中發(fā)揮各種重要作用，如改善缺血心肌能量代謝、抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生擬心肌缺血預(yù)適應(yīng)作用，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。至今只有一個(gè)ROCK抑制劑——法舒地爾上市，但科研人員仍然期待會(huì)有更多的基于抑制ROCK活性的藥物進(jìn)入醫(yī)藥市場(chǎng)。

1．1改善缺血心肌能量代謝 心肌是高度依賴于有氧氧化供應(yīng)能量的組織。心肌缺血是指心肌的供血量減少或心肌對(duì)氧的需求量增加超過(guò)其最大供血量，從而引起心肌代謝、功能和結(jié)構(gòu)改變［8］。

在大鼠離體心臟缺血／再灌注模型中，發(fā)現(xiàn)使用ROCK抑制劑Y-27632后，ATP合酶的兩個(gè)不同分子片段的體內(nèi)含量降低，并趨于正常值，說(shuō)明缺血／再灌注期間ATP合酶易于降解，而用Y-27632干預(yù)能夠通過(guò)抑制RhoA／ROCK通路，抑制ATP合酶的降解，增強(qiáng)其活性，促進(jìn)能量物質(zhì)的合成［9］。各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七皂苷R1能夠防止能量異常化，抑制ROCK的活性，恢復(fù)線粒體ATP合酶δ亞基的表達(dá)，從而防止心肌缺血／再灌注引起的能量代謝紊亂，增加能量物質(zhì)合成，最終減輕MIRI［10］，證明三七皂苷R1發(fā)揮類似于Y-27632的心肌保護(hù)作用。

所以，ROCK抑制劑可以通過(guò)抑制RhoA／ROCK通路，增強(qiáng)ATP合酶的活性，恢復(fù)ATP合酶δ亞基的表達(dá)，改善缺血心肌組織的能量代謝，恢復(fù)心肌的能量供應(yīng)。

1．2抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡 心肌缺血／再灌注期間，缺血部位通過(guò)釋放炎癥因子，引起心肌細(xì)胞凋亡，使心肌組織受到損傷。

小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Y-27632能抑制缺血／再灌注期間Bcl-2的下調(diào)和前炎癥細(xì)胞因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）、角質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)因子（keratinocyte chemoattractant，KC）、粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）的上調(diào)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，緩解炎癥反應(yīng)，減小心肌梗死面積，改善心肌生化參數(shù)以及灌注后心肌功能［11］。其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，法舒地爾能抑制MIRI誘導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子IL-6、CC趨化因子配體2（C-C motif chemoat-tractant ligand 2，CCL2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis fac-tor alpha，TNF-α）的表達(dá)，減小梗死面積，減輕心肌組織的白細(xì)胞浸潤(rùn)，最終發(fā)揮保護(hù)心肌的作用［12］。

法舒地爾保護(hù)心肌的作用機(jī)制可能是，通過(guò)抑制RhoA／ROCK通路而降低c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal ki-nase，JNK）活性，減少細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）從線粒體向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，并且JNK能調(diào)控AIF的轉(zhuǎn)運(yùn)，提示法舒地爾可通過(guò)作用于JNK調(diào)節(jié)的AIF轉(zhuǎn)運(yùn)而達(dá)到心肌保護(hù)作用［13］。在低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡模型中，其細(xì)胞凋亡水平、RhoA、ROCK1／2、磷酸化的磷脂酰肌醇激酶（p-PI3K）、磷酸化的蛋白激酶B（p-Akt）、caspase-3的表達(dá)水平均比對(duì)照組高，而Y-27632可降低上述指標(biāo)，說(shuō)明其機(jī)制可能作用于RhoA／ROCK1／2／PI3K／Akt／caspase-3通路，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用［14］。

因此，ROCK抑制劑可通過(guò)抑制RhoA／ROCK通路，減少M(fèi)IRI期間前炎癥因子的釋放，減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)，其抑制JNK調(diào)控的AIF核轉(zhuǎn)位，或通過(guò)RhoA／ROCK1／2／PI3K／Akt／caspase-3通路，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺血心肌。

1．3產(chǎn)生擬心肌缺血預(yù)適應(yīng)的作用 心肌在經(jīng)過(guò)短周期的缺血后能預(yù)防和消除隨后長(zhǎng)期有害的MIRI，即心肌缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IPC）。預(yù)適應(yīng)可以觸發(fā)機(jī)體的保護(hù)機(jī)制，而“再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑”（reperfusion in-jury salvage kinase，RISK）通路成為預(yù)適應(yīng)保護(hù)機(jī)制的研究熱點(diǎn)之一。RISK通路包括PI3K／Akt通路和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases／extracellular signal-regulated kinases，MAPK／ERK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB增加，導(dǎo)致效應(yīng)器的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗MIRI的作用［15］。

ROCK抑制劑主要作用于PI3K／Akt通路，起到擬IPC的作用。從離體大鼠心臟缺血時(shí)開(kāi)始，至再灌注10 min內(nèi)，給予法舒地爾和Y-27632，均能減小心肌缺血面積，抑制心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與在再灌注初始階段，抑制ROCK，激活PI3K／Akt／eNOS通路，從而達(dá)到保護(hù)心肌有關(guān)，說(shuō)明再灌注期間，RhoA／ROCK通路的激活可能通過(guò)RISK通路而產(chǎn)生損傷［16］。在動(dòng)物模型上，其他研究也進(jìn)一步證實(shí)了這一機(jī)制［17］。

有研究證明，在MIRI早期，使用法舒地爾并不是通過(guò)激活ERK1／2而產(chǎn)生擬IPC作用，因此抑制RhoA／ROCK并不激活ERK1／2［18］。但另有研究證實(shí)IPC與ERK／MAPK通路

存在聯(lián)系，ERK／MAPK位于ROCK的上游。在心肌缺血／再灌注期間，預(yù)先處理而產(chǎn)生預(yù)適應(yīng)作用的大鼠體內(nèi)ERK1／2活性明顯增加，并能降低ROCK活性，減少細(xì)胞凋亡數(shù)量。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，IPC激活ERK／MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制ROCK，從而抑制體內(nèi)細(xì)胞凋亡［19］。而上述兩個(gè)研究結(jié)果并不矛盾，也不會(huì)影響以下結(jié)論：ROCK抑制劑產(chǎn)生擬IPC作用并不上調(diào)ERK1／2的活性。

因此，在再灌注初始期，ROCK抑制劑可通過(guò)抑制RhoA／ROCK通路，進(jìn)而激活RISK通路中的PI3K／Akt通路，起到擬IPC的作用。

1．4調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 細(xì)胞內(nèi)Ca2＋超載或應(yīng)激產(chǎn)生的ROS是MIRI的重要機(jī)制。鈣穩(wěn)態(tài)紊亂可產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，正常內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊和折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)堆積，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也與肌漿網(wǎng)鈣ATP酶功能障礙有關(guān)［20］。

研究發(fā)現(xiàn)，在MIRI期間，法舒地爾可通過(guò)增加肌漿網(wǎng)鈣ATP酶的活性來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減小心肌梗死面積，從而保護(hù)心肌，其機(jī)制是通過(guò)抑制ROCK而共同作用于PI3K／Akt通路和JAK2／STAT3通路。此項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)，在MIRI早期，PI3K／Akt通路和JAK2／STAT3通路發(fā)揮同等重要的心肌保護(hù)作用。在MIRI后期，法舒地爾主要是作用于JAK2／STAT3通路，恢復(fù)受損肌漿網(wǎng)鈣ATP酶的表達(dá)和活性，從而保護(hù)心?。?0］。其中，JAK2／STAT3通路包含于“生存活化因子增強(qiáng)（survivor activating factor enhancement，SAFE）”通路。

在MIRI后期，ROCK抑制劑可恢復(fù)受損肌漿網(wǎng)鈣ATP酶的表達(dá)和活性，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減小心肌梗死面積而保護(hù)心臟。ROCK抑制劑在MIRI后期作用于SAFE通路，是對(duì)RISK通路的一個(gè)重要補(bǔ)充。

2　激活RhoA產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用及調(diào)控機(jī)制

鑒于RhoA信號(hào)通路具有多重的上游及下游信號(hào)調(diào)節(jié)分子，近年來(lái)隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，許多文獻(xiàn)資料報(bào)道了與以上研究相反的觀點(diǎn)，即激活RhoA在心臟的生理病理過(guò)程中具有積極作用，此作用主要通過(guò)除ROCK之外其他不同下游信號(hào)分子發(fā)揮心肌保護(hù)作用［21］。

研究發(fā)現(xiàn)，RhoA較高水平的急性激活，能保護(hù)心肌細(xì)胞免受凋亡損害。新生大鼠心室肌細(xì)胞（neonatal rat ventricu-lar myocytes，NRVMs）24h內(nèi)的RhoA激活并不誘發(fā)細(xì)胞凋亡，并且可以在H2O2和低糖損傷誘發(fā)的細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用，此作用依賴于ROCK活性、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的激活。研究證實(shí)，NRVMs中的FAK通過(guò)作為一個(gè)蛋白支架對(duì)RhoA信號(hào)做出回應(yīng)而發(fā)揮作用，同時(shí)招募PI3K的p85亞基，并激活A(yù)kt。機(jī)械牽張已被證實(shí)能在心肌細(xì)胞中激活RhoA，同時(shí)也可誘發(fā)FAK和Akt的活化。心肌細(xì)胞的FAK表達(dá)基因的敲除，可在MIRI中增加心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡。表明心肌細(xì)胞中RhoA通過(guò)激活下游靶點(diǎn)FAK，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用［22］。

研究證明，利用轉(zhuǎn)基因及基因敲除技術(shù)，建立持續(xù)性激活RhoA小鼠模型和RhoA基因敲除小鼠模型，并且RhoA的表達(dá)水平以不產(chǎn)生心肌肥大癥狀和心肌病為適宜，以此證實(shí)低水平持續(xù)性激活RhoA對(duì)體內(nèi)外MIRI的保護(hù)作用。RhoA在低水平上的持續(xù)性激活，可以在MIRI中減小心肌梗死面積，減少LDH的釋放，改善心臟功能參數(shù)，減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量。在此過(guò)程中傳統(tǒng)的RhoA下游分子，如活化的Akt、FAK、ERK、PKN以及iNOS、COX2、Bcl-2等并無(wú)明顯變化，而PKD的磷酸化水平明顯升高。因此，低水平持續(xù)性激活的RhoA可能通過(guò)RhoA／PKD信號(hào)通路在MIRI中發(fā)揮積極作用［21］。

在另一個(gè)探究1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1 phosphate，S1P）保護(hù)MIRI的作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，S1P可誘導(dǎo)活化RhoA的表達(dá)水平上升4－5倍，并利用RNA干涉的方法證實(shí)，磷脂酶Cε（PLCε）為S1P／RhoA的靶點(diǎn)而在S1P的保護(hù)作用中扮演重要角色，最終S1P通過(guò)RhoA和PLCε信號(hào)通路激活PKD。證明RhoA／PLCε／PKD通路是保護(hù)心臟的潛在的新通路［23］。

其他研究也證實(shí)，S1P通過(guò)激活RhoA可緩解在NRVMs上模擬的MIRI，減少細(xì)胞凋亡數(shù)量，并發(fā)現(xiàn)富半胱氨酸肝素結(jié)合蛋白61（cysteine rich heparin binding protein 61，CCN1）作為S1P的信號(hào)中介分子而起保護(hù)心肌作用。CCN1是一個(gè)多效性分子，在各種不同的刺激條件下可高水平表達(dá)。CCN1的功能包括，細(xì)胞遷移、增殖、分化、存活／凋亡和衰老等的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞水平對(duì)S1P保護(hù)心臟的新機(jī)制研究結(jié)果顯示，采用基因敲除技術(shù)和RhoA及其下游分子的激動(dòng)劑或抑制劑，發(fā)現(xiàn)在MIRI模型中，S1P通過(guò)RhoA／MRTF-A信號(hào)通路激活CCN1，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。離體心臟實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持了此機(jī)制的成立。所以在再灌注期間，RhoA和CCN1的早期激活，對(duì)保護(hù)心肌細(xì)胞將是一個(gè)新的治療方法，并可控制心臟缺血／再灌注發(fā)展為心力衰竭和心肌重構(gòu)［24］。

3　結(jié)語(yǔ)與展望

目前更多的研究策略是通過(guò)抑制RhoA／ROCK通路而治療包括MIRI在內(nèi)的心血管疾病，研究熱點(diǎn)主要集中在選擇性ROCK抑制劑的研究和開(kāi)發(fā)。眾所周知，RhoA信號(hào)通路涉及多種上游和下游信號(hào)分子，而從上游可知，每條通路可能發(fā)揮著不同甚至相反的作用。所以單純地激活或抑制RhoA的表達(dá)，并不能同時(shí)控制多條通路發(fā)揮不同作用。在不斷發(fā)現(xiàn)不同的RhoA調(diào)控通路的情況下，在心肌缺血／再灌注的不同時(shí)期，針對(duì)性地、適宜地激活或抑制RhoA及下游信號(hào)分子的表達(dá)和活性，能夠發(fā)揮有效的心肌保護(hù)作用。同時(shí)，研究和開(kāi)發(fā)針對(duì)RhoA不同通路不同時(shí)期的MIRI治療藥物，可使藥物治療策略更加豐富，也可期待藥物療效的提高和副作用的降低。

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Research advances on regulatory effect of RhoA on myocardial ischemia reperfusion injury

LIN Yi-huang，F(xiàn)ANG Lian-hua，DU Guan-hua
（Beijing Key Laboratory of Drug Targets Identification and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

Abstract：RhoA belongs to the small G binding proteins Rho subfamily，playing an important role in the various cellular func-tions，including migration，proliferation，adhesion and apopto-sis．Recent data indicate that RhoA／ROCK pathway causes myo-cardial damage by influencing the myocardial energy metabolism，inflammation，and endoplasmic reticulum stress．On the other hand，the activation of RhoA also has a positive role in MIRI． This article reviews the regulatory effect of RhoA on MIRI and its mechanisms，discusses the prospects of RhoA as a novel thera-peutic target for MIRI，and provides new therapeutic treatments and strategies for MIRI．

Key words：RhoA；myocardial ischemia reperfusion；ROCK；regulatory mechanism；drug targets；ischemic heart disease

作者簡(jiǎn)介：林溢煌（1991－），男，碩士生，研究方向：心腦血管藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，Tel：010-63131571，E-mail：lyh＠imm．a(chǎn)c．cn；方蓮花（1963－），女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：心腦血管藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，Tel：010-63165313，E-mail：fanglh＠imm．a(chǎn)c．cn杜冠華（1956－），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，Tel：010-63165184，E-mail：dugh＠imm．a(chǎn)c．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（No 2013ZX09103001-008，2012ZX09103101-078，2013ZX09508104）

收稿日期：2015－05－07，修回日期：2015－06－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）10－1336－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．002