姜曉東，閻政禮，汪耀珠，周桂鳳

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙 410013）

激活視網(wǎng)膜水平細(xì)胞NMDA受體抑制內(nèi)向整流鉀通道活動(dòng)

姜曉東，閻政禮，汪耀珠，周桂鳳

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙 410013）

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R322.91；R329.24；R348.1；R392.11

摘要：目的 探討視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上激活NMDA受體對(duì)其內(nèi)向整流鉀通道的調(diào)控作用。方法 采用酶解分離的視網(wǎng)膜水平細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄，在給藥激活NMDA受體前后，分別記錄內(nèi)向整流鉀通道的電流大??；另外在無(wú)鈣及螯合胞內(nèi)鈣條件下，觀察NMDA受體對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的作用。結(jié)果 激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流減小，灌流洗脫后電流恢復(fù)；在無(wú)鈣和螯合胞內(nèi)鈣的條件下，激活NMDA受體不能改變內(nèi)向整流鉀通道活動(dòng)。結(jié)論 激活視網(wǎng)膜水平細(xì)胞NMDA受體可以通過(guò)胞內(nèi)鈣信號(hào)抑制內(nèi)向整流鉀通道電流。

關(guān)鍵詞：視網(wǎng)膜；內(nèi)向整流鉀通道；鈣，胞內(nèi)鈣庫(kù)；NMDA受體；膜片鉗

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．056．html

視網(wǎng)膜水平細(xì)胞是視網(wǎng)膜外網(wǎng)狀層的抑制性中間神經(jīng)元，其接受來(lái)自光感受器細(xì)胞的谷氨酸能輸入，釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA），反饋抑制光感受器細(xì)胞。同時(shí)水平細(xì)胞的突起廣泛伸展于外網(wǎng)狀層，橫向調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜信息傳遞，參與雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的感受野的形成［1］。

水平細(xì)胞膜上表達(dá)豐富的內(nèi)向整流鉀通道，在細(xì)胞超極化時(shí)開(kāi)放，促進(jìn)鉀離子內(nèi)流，使得細(xì)胞恢復(fù)在靜息電位，對(duì)于細(xì)胞興奮性的調(diào)節(jié)非常重要。同時(shí)，也有研究表明，內(nèi)向整流鉀通道的開(kāi)放可以提升水平細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)的速率，參與調(diào)節(jié)視覺(jué)信息調(diào)控［2］。視網(wǎng)膜內(nèi)向整流鉀通道的下調(diào)同時(shí)也參與缺血、糖尿病視網(wǎng)膜病變等很多病理調(diào)節(jié)過(guò)程［3－4］。

離子型谷氨酸受體可以分為NMDA受體和非NMDA受體（如AMPA受體）。過(guò)去認(rèn)為NMDA受體主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上，水平細(xì)胞上表達(dá)的谷氨酸受體是AMPA受體。隨后也發(fā)現(xiàn)在水平細(xì)胞上也同時(shí)表達(dá)NMDA受體，但其功能缺少研究［5－6］。NMDA受體在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上的功能主要是接受突觸前的谷氨酸輸入，形成動(dòng)作電位［7］。而水平細(xì)胞作為中間神經(jīng)元，不發(fā)放動(dòng)作電位，作者前期工作表明，激活水平細(xì)胞NMDA受體可以抑制GA-BA轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)［8］。在視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Müller細(xì)胞）上NMDA受體的激活，可以抑制內(nèi)向整流鉀通道的活動(dòng)［9］。在水平細(xì)胞上NMDA的該功能尚無(wú)研究，基于在鯽魚(yú)視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上的研究基礎(chǔ)，本文NMDA受體的激活對(duì)內(nèi)向整流鉀通道是否有調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1．1細(xì)胞分離 根據(jù)文獻(xiàn)［5］，分離的視網(wǎng)膜水平細(xì)胞取自成年鯽魚(yú)（carassius auratus，體長(zhǎng)15～20 cm）。在通O2的Hank′s液中，將鯽魚(yú)眼球鞏膜剪開(kāi)。分離出視網(wǎng)膜，剪成8～12片，置于含有木瓜蛋白酶（2×104U·L－1）和L-半胱氨酸（5 mmol· L－1）的Hanks′s液體中，在室溫下消化20 min。然后用玻璃吸管輕柔吹打視網(wǎng)膜片至溶液渾濁。靜置沉降5 min后，取細(xì)胞懸浮液于培養(yǎng)皿內(nèi)鏡下依據(jù)特異形態(tài)觀察H1型水平細(xì)胞。

1．2全細(xì)胞記錄和給藥 水平細(xì)胞的全細(xì)胞記錄采用Axon 200B膜片鉗系統(tǒng)（Axon Instruments，USA），鉗制電壓為－60mV。記錄電極（Sutter In-struments，USA）采用水平拉制儀器拉制，電極電阻在5～8 MΩ。灌充電極內(nèi)液后，將電極安裝在膜片鉗夾持器上，之后采用微動(dòng)操作儀（SD Instruments，USA）操作。參考電極采用Ag／AgCl電極。補(bǔ)償細(xì)胞快、慢電容，并適當(dāng)補(bǔ)償串聯(lián)電阻。數(shù)據(jù)采集軟件采用AxoScope（Axon Instruments，USA），采樣率1kHz。數(shù)據(jù)分析采用Clampfit 9.2（Axon Instru-ments，USA）。

NMDA的快速給藥，采用DAD-12給藥系統(tǒng)（ALA Scientific，USA）。在所有實(shí)驗(yàn)中，NMDA （100 μmol·L－1）與glycine（100 μmol·L－1）共同給藥。

1．3溶液 Hank′s液包括（mmol·L－1）：NaCl

120，MgSO41.0，KCl 3.0，CaCl20.5，HEPES 20.0，Na-pyruvate 1.0，NaH2PO41.0，NaHCO30.5，glu-cose 16.0。無(wú)Mg2＋的Ringer′s液含有（mmol· L－1）：NaCl 120.0，KCl 5.0，CaCl22.0，HEPES 10.0，glucose 16.0。Ryanodine和thapsigargin采用DMSO配成母液，臨用前加入Ringer′s液，DMSO終濃度＜0.5%。NMDA和AP-5采用Ringer′s液溶解。Hank′s液和Ringer′s液的pH值采用NaOH調(diào)整至7.4。膜片鉗記錄電極內(nèi)液包含（mmol· L－1）：KCl 140.0，MgSO41.0，EGTA 0.5，CaCl20.05，HEPES 10.0。pH值用KOH調(diào)整至7.3。所用藥品購(gòu)買于Sigma公司（St.Louis，MO，USA）。

2　結(jié)果

2．1視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上的NMDA受體和內(nèi)向整流鉀通道 采用急性分離的H1型視網(wǎng)膜水平細(xì)胞（Fig 1A）進(jìn)行全細(xì)胞電壓鉗記錄，鉗制電壓為－60 mV。當(dāng)快速給予NMDA（100 μmol·L－1）和Gly-cine（100 μmol·L－1）時(shí)，可以記錄到明顯的內(nèi)向電流，即NMDA受體激活引發(fā)的電流，此電流可以被NMDA受體阻斷劑AP5所阻斷（Fig 1B）。

視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上的內(nèi)向整流鉀通道可以隨細(xì)胞膜的超極化而激活。內(nèi)向整流鉀通道可以被溶液中的Cs＋所抑制。當(dāng)灌流液中加入Cs＋后，在－120mV超極化所記錄的電流由正常時(shí)的－1241.1 pA下降到－185.3 pA（Fig 1C）。

2．2激活視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上的NMDA受體抑制內(nèi)向整流鉀通道的活動(dòng) Fig 2A所示1例細(xì)胞在全細(xì)胞記錄模式下，給予－40 mV到－120 mV的階梯電壓，可以觀測(cè)到內(nèi)向整流鉀通道電流逐漸增強(qiáng)。在－120mV下的電流為－1136.1 pA。當(dāng)在灌流液中加入NMDA（100 μmol·L－1）和Glycine（100 μmol·L－1），預(yù)灌流10 s后，待電流恢復(fù)到基線，再改變鉗制電壓觀察內(nèi)向整流鉀通道活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)在各電壓下，內(nèi)向電流均有減弱，在－120mV下，內(nèi)向電流為－583.5 pA。灌流沖洗5 min后，內(nèi)向電流的幅度得以恢復(fù)。以－120mV處的內(nèi)向?yàn)椋?54.8 pA。Fig 2B所示5個(gè)細(xì)胞在不同電壓下的電流變化，其中的條形圖顯示5例細(xì)胞在－120mV處以正常條件作為歸一化標(biāo)準(zhǔn)（100%），在激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流下降到正常水平的64.1%±6.2%（P＜0.05，paired t-test），灌流沖洗后，恢復(fù)到正常水平的84.3%±6.3%（P＞0.05，paired t-test）。Fig 2C所示，在100 μmol·L－1的NMDA受體阻斷劑AP5存在的情況下，給予NMDA后，內(nèi)向整流鉀通道電流為對(duì)照水平的95.1%± 2.7%（P＞0.05，paired t-test）；灌流沖洗后，恢復(fù)到正常水平的92.5%±6.5%（P＞0.05，paired t-test），AP5阻斷了NMDA對(duì)內(nèi)向整流鉀通道電流的調(diào)控作用。Fig 3所示不同濃度NMDA對(duì)內(nèi)向整流鉀通道抑制效應(yīng)，劑量－效應(yīng)曲線采用希爾方程擬合，半效濃度為86.0 μmol·L－1，希爾系數(shù)（n）為0.9。

Fig 1 NMDA receptors and inward rectifying potassium channels on a retinal horizontal cell

2．3細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)參與NMDA受體對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的調(diào)控 由于NMDA受體激活時(shí)，可以向胞內(nèi)通透鈣離子。而鈣離子作為細(xì)胞的第二信使，參與胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)控。為了研究NMDA受體激活所介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣濃度增高是否參與對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的調(diào)控，采用無(wú)鈣離子的細(xì)胞外液灌流，并在電極內(nèi)液中添加BAPTA螯合胞內(nèi)鈣離子。Fig 4所示1例細(xì)胞，在－120mV下測(cè)定的內(nèi)向整流鉀通道電流為－1467.2 pA，在給予NMDA（100 μmol·L－1）和Glycine（100 μmol·L－1）3 min后，電流為1439.5

pA，灌流沖洗后，電流為1353.8 pA。Fig 4的條形小圖表示5例細(xì)胞在－120mV處以正常條件作為歸一化標(biāo)準(zhǔn)（100%），在激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流為到正常水平的96.4%±2.0%（P＞0.05，paired t-test），灌流沖洗后，恢復(fù)到正常水平的88.0%±4.2%（P＞0.05，paired t-test）。

Fig 2 Inhibition of inward potassium currents by activation of NMDA receptors

Fig 3 Dose-effect curve of NMDA on inward potassium currents was fitted by Hill equation，in which each point with 5 cells

Fig 4 When calcium was removed，I－V curves of a horizontal cell were established under control，application of NMDA and wash con-ditions．Small figure showed NMDA modulation of normalized cur-rents from 5 cells under－120mV．

3　討論

在視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上的谷氨酸受體，早期研究集中于AMPA受體的研究，后來(lái)發(fā)現(xiàn)NMDA受體也共同表達(dá)在水平細(xì)胞上，但功能尚需缺乏研究［6］。本文在鯽魚(yú)視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，激活NMDA受體后，內(nèi)向整流鉀通道電流受到抑制。由于NMDA

受體是鈣離子通透的，為了驗(yàn)證該離子作為第二信是否參與NMDA受體對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的調(diào)控，在去除灌流液的鈣離子的同時(shí)，在電極內(nèi)液中加入鈣離子的快速螯合劑BAPTA后，發(fā)現(xiàn)激活NMDA受體對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的抑制作用消失，表明鈣信號(hào)參與了這個(gè)調(diào)控過(guò)程。根據(jù)前期工作，激活視網(wǎng)膜水平細(xì)胞NMDA受體的內(nèi)流鈣離子可以通過(guò)觸發(fā)胞內(nèi)鈣庫(kù)的以鈣釋鈣過(guò)程，提升胞內(nèi)鈣離子濃度。鈣作為第二信使，進(jìn)而通過(guò)鈣調(diào)蛋白及其依賴的蛋白激酶信號(hào)通路，調(diào)節(jié)鈉離子通道和鈣離子通道的功能。在視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞（Müller細(xì)胞）上，激活NMDA受體也是通過(guò)鈣離子信號(hào)途徑調(diào)節(jié)內(nèi)向整流鉀通道活動(dòng)的［9］。因此，在本文研究的水平細(xì)胞上，激活NMDA受體后，鈣信號(hào)參與了對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的抑制調(diào)控過(guò)程。

神經(jīng)系統(tǒng)中，內(nèi)向整流鉀通道對(duì)于細(xì)胞內(nèi)外的鉀離子平衡很重要。內(nèi)向整流是指該通道在細(xì)胞膜超極化時(shí)候的內(nèi)向電流大于去極化時(shí)的外向電流。內(nèi)向整流鉀通道在視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上當(dāng)膜電位負(fù)于－30 mV時(shí)開(kāi)放，并隨著超極化程度的增強(qiáng)，電流增大。而在細(xì)胞去極化時(shí)，內(nèi)向整理鉀通道關(guān)閉。在視網(wǎng)膜水平細(xì)胞上，同時(shí)表達(dá)延遲整流鉀通道、電壓門控鈉通道和鈣通道，這些通道分別處于膜電位高于－20 mV、－30 mV及－40 mV的去極化狀態(tài)才開(kāi)放［10］。本文中內(nèi)向整流鉀通道的電流在－120 mV下的超極化下測(cè)定，可以排除這些電壓門控通道的影響。

在生理?xiàng)l件下，水平細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道在去極化（高于－40 mV）時(shí)，內(nèi)向整流鉀通道幾乎關(guān)閉，在－60mV以下開(kāi)放，鉀離子內(nèi)流，避免細(xì)胞過(guò)度超極化，有助于細(xì)胞穩(wěn)定在靜息電位，參與細(xì)胞興奮性的調(diào)控。也有文獻(xiàn)報(bào)道［2］，內(nèi)向整流鉀通道的開(kāi)放可以提高水平細(xì)胞的對(duì)光反應(yīng)速率，調(diào)節(jié)水平細(xì)胞的生理功能。本文中，谷氨酸可以通過(guò)激活NMDA受體抑制內(nèi)向整流鉀通道。可以推測(cè)，在暗中，光感受器細(xì)胞持續(xù)釋放谷氨酸，通過(guò)抑制內(nèi)向整流鉀通道，降低水平細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)速率，來(lái)提高暗中的敏感度；在明亮中，光感受器釋放谷氨酸降低，水平細(xì)胞內(nèi)向整流鉀通道的抑制解除，對(duì)光反應(yīng)速率提高，進(jìn)而提升在明亮環(huán)境下的視覺(jué)的時(shí)間分辨率。

在病理?xiàng)l件下，內(nèi)向整流鉀通道促進(jìn)鉀內(nèi)流，具有保護(hù)作用。視網(wǎng)膜在缺血／再灌注條件下［11］，Müller細(xì)胞內(nèi)向整理鉀通道電流下降；在大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜內(nèi)向整流鉀通道表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)重?cái)z取等功能損害［12－13］。在缺血等狀態(tài)下，視網(wǎng)膜中谷氨酸累積增加，NMDA受體激活［14］，抑制內(nèi)向整流鉀通道，可能會(huì)加劇損害作用。而避免NMDA受體的過(guò)度激活，減弱其對(duì)內(nèi)向整流鉀通道的抑制，可能是緩解視網(wǎng)膜病理?yè)p傷的潛在靶點(diǎn)。

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Inhibition of inward rectifying potassium channels by activation of NMDA receptors on retinal horizontal cell

JIANG Xiao-dong，YAN Zheng-li，WANG Yao-zhu，ZHOU Gui-feng
（Dept of preventive medicine Medical College，Hunan Normal University，Changsha 410013，China）

Abstract：Aim To study modulation of NMDA recep-tors on inward rectifying potassium channels through investigation of retinal horizontal cells．Methods Whole cell recording was conducted on isolated retinal horizontal cells for observation of inward-rectifying po-tassium currents before and after application of NMDA．Modulation of inward-rectifying currents by NMDA re-ceptor was also tested under calcium-free and chelation of intracellular calcium condition．Results Reduction of inward rectifying potassium currents was induced by activation of NMDA receptors．The effect was attenua-ted when calcium was removed．Conclusion Inhibi-tion of inward rectifying potassium channels can be in-duced by activation of NMDA receptors via intracellular calcium signals．

Key words：retina；inward-rectifying channel；calci-um，intracellular calcium store；NMDA receptor；patch clamp

作者簡(jiǎn)介：姜曉東（1977－），男，博士，講師，研究方向：神經(jīng)毒理學(xué)，E-mail：mailofjxd＠gmail．com；周桂鳳（1958－），女，博士，教授，研究方向：神經(jīng)毒理學(xué)，E-mail：56946349＠qq．com

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳青年基金（No 12B074）；湖南省衛(wèi)生廳基金資助（No B2012-62）；湖南師范大學(xué)教改課題“基于網(wǎng)絡(luò)課程《毒理學(xué)基礎(chǔ)》的PBL教學(xué)方法實(shí)證研究”

收稿日期：2015－06－10，修回日期：2015－07－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）10－1469－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．028