（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 555000）

尼帕病毒的診斷技術(shù)研究進(jìn)展

吳玙彤，謝麗麗

（貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 555000）

尼帕病毒病是嚴(yán)重危害人類(lèi)與養(yǎng)豬業(yè)的一種較新的人畜共患病。文章中著重闡述了近年來(lái)在其實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)方面的研究進(jìn)展，以期為該病的深入研究提供參考。

尼帕病毒；豬；實(shí)驗(yàn)室診斷

尼帕病毒病(NVD)是由尼帕病毒引起的一種新的人畜共患病毒性疾病，于1997年在馬來(lái)西亞森美蘭洲雙溪尼帕城首次發(fā)現(xiàn)[1]，是繼瘋牛病、口蹄疫、禽流感后又一引起世界各國(guó)廣泛關(guān)注和恐慌的人畜共患病。生豬感染該病毒后，出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難及腦炎癥狀；母豬感染該病毒后表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，可能會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)或突然死亡；人感染該病毒后發(fā)生病毒性腦炎而死亡[2]。由于其引起人感染后的高死亡率，缺乏有效的疫苗和治療方法，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和我國(guó)農(nóng)業(yè)部都將其列為生物安全4級(jí)病原體。

1 概況

尼帕病毒病是由副黏病毒科亨尼帕病毒屬(Henipavi rus)的尼帕病毒(NiV)引起的一種人畜共患傳染病。NiV是新發(fā)現(xiàn)于蝙蝠的一種副黏病毒，1999年3月初，從Sungai Nipah村1名腦炎患者的腦脊液中分離到了一種新的副黏病毒，并確定為該次暴發(fā)的病原，因此命名為尼帕病毒(Nipah virus)[3]。血清學(xué)檢測(cè)顯示，家養(yǎng)動(dòng)物如狗、貓、馬和山羊均可感染尼帕病毒，但豬是其他家養(yǎng)動(dòng)物的傳染源[4]。尼帕病毒可感染不同年齡的豬，從1998年馬來(lái)西亞暴發(fā)尼帕病毒病以來(lái)，已造成許多人和豬傷亡，引起了巨大的社會(huì)恐慌，并給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

2.1 病原學(xué)檢測(cè)

2.1.1 NiV分離鑒定

NiV能夠在多種培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)并快速增殖至較高的滴度。非洲綠猴腎細(xì)胞和兔腎細(xì)胞RK-13細(xì)胞系對(duì)NiV尤為敏感。通常在病毒感染3 d內(nèi)能夠觀察到病毒病變效應(yīng)(CPE)，但一般來(lái)說(shuō)在細(xì)胞上傳代2次，每次5 d所達(dá)到的分離效果更為穩(wěn)定。經(jīng)低毒量穩(wěn)定傳代后的病毒再次感染細(xì)胞后24～48 h，細(xì)胞出現(xiàn)以形成合胞體為特征的CPE，并且感染早期，合胞體中所有細(xì)胞核位于合胞體中央，而晚期則被運(yùn)送至合胞體外，并聚集在其周?chē)鶾5]。由于NiV在體外細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)增迅速，并且能產(chǎn)生大量的病毒抗原，所以采用免疫熒光或免疫電鏡法檢測(cè)分離培養(yǎng)該病毒，最為方便快速。

2.1.2 分子診斷技術(shù)

NiV的基因組全序列已被測(cè)出[6]，研究者們可以在此基礎(chǔ)上針對(duì)NiV的分子診斷技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的研發(fā)。目前，已經(jīng)被報(bào)道的針對(duì)NiV的分子檢測(cè)技術(shù)有2種，分別為熒光定量RT-PCR和雙重套式RT-PCR。

2.1.2.1 熒光定量RT-PCR

該方法敏感度高、特異性強(qiáng)，并且不需要接觸活的感染性病毒，具有生物安全性的優(yōu)勢(shì)。其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1個(gè)空斑形成單位 （PFU）[7]，并且有被學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可的相關(guān)引物和探針有：

5′－TCAGCAGGAAGGCAAGA GAGTAA－3′（Primer1），

5′－CCCCTTCATCGATATC TTGATCA－3′（Primer2），

5′－6FAM－CCTCCAATGAG CACACCTCCTGCAGTAMRA－3′（TaqMan probe），為NiV的實(shí)驗(yàn)室快速診斷提供了技術(shù)支持。

2.1.2.2 雙重套式RT-PCR：

Wacharapluesadee等描述了一種帶有內(nèi)參的雙重套式RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)能夠用于對(duì)果蝠尿樣的檢測(cè)，并且加入內(nèi)參大大降低PCR相關(guān)的抑制因素帶來(lái)的假陰性的結(jié)果，提高檢出準(zhǔn)確率，在NiV流行病學(xué)調(diào)查時(shí)大大提高NiV監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性。

2.1.3 其他診斷技術(shù)

主要針對(duì)NiV全病毒抗原或病毒主要致病抗原（如F蛋白和G蛋白等）制備特異性的病毒抗血清或單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立病毒中和試驗(yàn)、免疫組化以及免疫熒光等方法檢測(cè)NiV相關(guān)抗原。病毒中和試驗(yàn)主要包括傳統(tǒng)的空斑抑制試驗(yàn)、微孔板中和試驗(yàn)以及免疫空斑試驗(yàn)3種，分別通過(guò)計(jì)算空斑形成單位（PFU）、組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）以及病灶形成單位（FFU）達(dá)到檢測(cè)病毒抗原或抗體的目的。檢測(cè)NiV的病毒中和試驗(yàn)需要在BSL4級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但近年來(lái)研究者們陸續(xù)開(kāi)發(fā)了幾種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)z測(cè)NiV的生物安全水平降低至BSL2級(jí)，為偏遠(yuǎn)地區(qū)NiV檢測(cè)提供了幫助。由于NiV原發(fā)于血管內(nèi)壁，所以病死畜的多個(gè)器官均可用于免疫組化的檢測(cè)，尤其是肺臟。

目前，研究者們已經(jīng)針對(duì)NiV的免疫組化法檢測(cè)研發(fā)了幾個(gè)檢測(cè)體系，為該病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)

鑒于NiV的生物危害性，用于該病毒血清學(xué)診斷的所有血清樣品必需進(jìn)行安全化處理，以盡量減少實(shí)驗(yàn)室工作人員接觸NiV的風(fēng)險(xiǎn)?？梢杂? kGy的γ射線輻照或含0.05% Tween20和0.5% Triton—X100 PBS（磷酸緩沖液） 1/5 稀釋后56 ℃ 30 min滅活的方法對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理。目前常用的NiV的血清學(xué)檢測(cè)方法包括病毒中和試驗(yàn)和ELISA試驗(yàn)。

2.2.1 病毒中和試驗(yàn)

目前針對(duì)NiV抗體檢測(cè)的病毒中和試驗(yàn)已經(jīng)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法，Kaku等人利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了共表達(dá)NiV F或G蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）的重組水泡性口炎病毒，作為已知病毒抗原檢測(cè)NiV血清樣本，用該重組病毒作為已知病毒抗原的好處在于GFP是可見(jiàn)的，可以在熒光顯微鏡下直觀地?cái)?shù)出熒光斑點(diǎn)的數(shù)量而獲知血清樣品中NiV特異性抗體的含量。該方法要比傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)更為迅速、安全和靈敏。Tamin同樣也利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)F或G蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原，檢測(cè)NiV抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)NiV抗體的空斑抑制試驗(yàn)。

2.2.2 ELISA

目前，針對(duì)NiV抗體檢測(cè)的ELISA技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出間接ELISA和捕獲ELISA 2種。Daniels在1999年召開(kāi)的國(guó)際豬病監(jiān)測(cè)會(huì)議中提出了一種用非離子去污劑處理NiV感染的細(xì)胞以獲得ELISA檢測(cè)用NiV抗原的方法，隨后，為消除ELISA的非特異性，研究者們又在此基礎(chǔ)上加入了非感染細(xì)胞作為對(duì)照。美國(guó)疾病控制中心開(kāi)發(fā)出能夠檢測(cè)針對(duì)NiV IgG和IgM 2種亞型免疫球蛋白的ELISA技術(shù)。此外，Yu等人也報(bào)道過(guò)用NiV N蛋白作為病毒抗原檢測(cè)IgG和IgM 2種亞型免疫球蛋白的ELISA方法。

3 防控措施

目前對(duì)該病尚無(wú)有效的藥物和治療方法，只能采取強(qiáng)制措施，監(jiān)測(cè)并淘汰患病動(dòng)物，以免傳染給人；防止家豬與野豬的接觸；禁止運(yùn)輸和進(jìn)口患病豬及其肉制品；對(duì)豬舍進(jìn)行消毒，搞好清潔衛(wèi)生工作。人感染后，用廣譜抗病毒藥Ribavirin(利巴韋林)，可減少發(fā)燒時(shí)間，緩解發(fā)病程度，降低急性腦炎死亡率。隨著科學(xué)家對(duì)這一病原的不斷了解，人們利用皰疹病毒為載體進(jìn)行F、G融合蛋白克隆，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，有可能用來(lái)防治尼帕病毒的感染，其他相關(guān)的疫苗正在研究開(kāi)發(fā)中。

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；2015-09-17)