張志剛，楊自文，王開梅，張露云

摘要：采用水瓊脂表面涂布法對擬南芥（Arabidopsis thaliana）的發(fā)芽率和對常用溶劑敏感性進(jìn)行了試驗(yàn)，用幾個常用靶標(biāo)對2個除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品和7個除草劑商品制劑進(jìn)行了除草活性測定，同時對1 880個微生物源提取物進(jìn)行了篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，擬南芥用于先導(dǎo)化合物篩選具有穩(wěn)定、高效、操作簡單和敏感性高等突出優(yōu)點(diǎn);使用擬南芥可有效的減少低活性樣品的漏篩;擬南芥是雙子葉除草劑先導(dǎo)化合物篩選的首選靶標(biāo)之一。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）;先導(dǎo)化合物;除草活性;微生物源提取物;雙子葉植物。

中圖分類號：S482.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5731-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.026

除草劑先導(dǎo)化合物篩選與除草劑農(nóng)藥活性生物測定在靶標(biāo)設(shè)定上有很大差別。除草劑先導(dǎo)化合物篩選對象是低含量、低活性的先導(dǎo)化合物。因?yàn)橄葘?dǎo)化合物在原材料中含量低、活性低，其對常規(guī)的中、低敏感度的農(nóng)藥生物測定靶標(biāo)無明顯活性甚至不顯示活性，所以提高檢測敏感度和增加篩選通量是先導(dǎo)化合物篩選成功的關(guān)鍵。先導(dǎo)化合物篩選必需使用高度敏感的靶標(biāo)，以增大具有潛在農(nóng)藥活性的先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)機(jī)率。擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為遺傳學(xué)和植物發(fā)育研究中的模式生物之一，在農(nóng)業(yè)科學(xué)中所扮演的角色正如小鼠和果蠅在人類生物學(xué)研究一樣。擬南芥嚴(yán)格自花受粉的特點(diǎn)可以保證種質(zhì)資源的一致性和穩(wěn)定性。使用擬南芥進(jìn)行除草劑先導(dǎo)化合物篩選，不僅極大提高篩選的敏感度，減少漏篩，而且突破了使用雜草種子在種子資源少和種子品質(zhì)差異大等不利因素的限制。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?擬南芥種子 ?試驗(yàn)使用的擬南芥種子為哥倫比亞野生型，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供。試驗(yàn)用種子保存在具透氣塞的玻璃管中，保存溫度為20 ℃。

1.1.2 ?供試靶標(biāo) ?狗牙根、油菜為市售種子，反枝莧種子和浮萍為武漢地區(qū)野外采集。

1.1.3 ?瓊脂粉 ?北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，型號DH010-40。

1.1.4 ?試劑與標(biāo)準(zhǔn)樣品 ?用于靶標(biāo)表面處理的試劑：75%酒精、2%次氯酸鈉溶液。常用溶劑：丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、吐溫-80，以上試劑均為市售分析純化學(xué)試劑。除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品：乙草胺（95%）、硝磺草酮（98%）。商品除草劑：氟吡甲禾靈、精異丙甲草胺、精喹禾靈、氯氟吡氧乙酸、水花生必殺（復(fù)配）、2甲4氯鈉、2甲4氯二甲胺鹽，以上樣品均為市售商品除草劑。

1.1.5 ?放線菌和真菌發(fā)酵提取物 ?由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心先導(dǎo)化合物研究室提供。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?擬南芥種子表面處理及篩選用培養(yǎng)板制備[1] ?稱取1.0 g擬南芥種子置于80 mL離心管中，先用75%酒精浸泡30 s，快速移出酒精，再經(jīng)2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再以無菌水反復(fù)振蕩、浸洗5次以上，最后移除積水備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的0.5%的黃原膠50 mL加入盛有1.0 g種子的80 mL離心管中，用旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩3～5 min，使種子分散均勻，倒入長方形加樣盒中備用。把經(jīng)過高壓滅菌后的0.7%的瓊脂加入96孔組織培養(yǎng)板（深孔）[2]，每孔加入量1 mL，冷卻后備用。把黃原膠與種子混合物轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，接入量為20 μL/孔（接種量為30～40粒種子/孔）。

1.2.2 ?擬南芥種子春化處理試驗(yàn)[3] ?成熟的擬南芥種子經(jīng)歷低溫進(jìn)行春化后才能快速同步發(fā)芽。常用的春化方法是播種后，種子與培養(yǎng)基一起進(jìn)行4 ℃低溫處理（4 d）。這種方法可以用于擬南芥的人工栽培，但不適用于生物測定。所以本試驗(yàn)采用干燥種子進(jìn)行低溫春化。干燥的種子春化處理分為5組：第1組收獲后持續(xù)保存在20 ℃;第2組在4 ℃冰箱中春化處理7 d;第3組在4 ℃冰箱中春化處理14 d;第4組在4℃冰箱中春化處理21 d;第5組為在4℃冰箱中春化處理28 d。按1.2.1中的方法把經(jīng)過不同時間春化處理的種子接入96孔組織培養(yǎng)板中的瓊脂上，加蓋培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度18 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度8 000 lx。每組使用2個組織培養(yǎng)板，重復(fù)3次。培養(yǎng)4 d后檢查種子發(fā)芽情況，記錄發(fā)芽率。

1.2.3 ?常用溶劑對擬南芥種子發(fā)芽的影響試驗(yàn) ?把丙酮、乙醇、二甲基亞砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和甲醇分別制備成10%的母液。在組織培養(yǎng)板中加入不同量的各溶劑母液。按1.2.1的方法接入擬南芥種子。每個濃度設(shè)2組，每組重復(fù)3次，5 d后以目測法確定擬南芥生長是否受影響。第1組：接入種子后的組織培養(yǎng)板在無菌操作臺上靜置4 h后，加蓋培養(yǎng);第2組：接入種子的組織培養(yǎng)板直接加蓋后移入人工氣候室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度18 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度8 000 lx。

1.2.4 ?除草劑篩選靶標(biāo)對除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品及商品制劑的敏感性比較[3] ?活性評價指標(biāo)：根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用分級指標(biāo)數(shù)（0、3、5、7、9）標(biāo)記除草活性[4]。除草劑對常規(guī)篩選靶標(biāo)的敏感性試驗(yàn)：將樣品配制成母液，濃度為1.00 mg/mL，以含0.1% 吐溫-80的無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度。各組織培養(yǎng)板中瓊脂表面涂布樣品溶液量為0.02 mL/孔，按1.2.1的方法接入擬南芥種子。每個濃度設(shè)2個重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)3次。培養(yǎng)條件為：溫度18 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度8 000 lx。7 d后檢查并記錄結(jié)果，計算LC50。