田宇曦，劉曉艷，張志剛，楊自文

摘要：通過PCR技術將2種不同來源的蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）cry1Ac蛋白基因克隆到大腸桿菌pGEX-6P-1表達載體，并轉化到宿主菌BL21，采用IPTG進行誘導表達，并用親和層析法進行融合蛋白的純化，純化后的蛋白質進行玉米螟的室內生物測定試驗。結果表明，來自Bt菌株NBIN-866的Cry1Ac蛋白殺玉米螟的LC50為65.39 μg/mL，來自Bt菌株NBIC-380的Cry1Ac蛋白殺玉米螟的LC50為15.07 μg/mL，后者具有更高的殺蟲活性。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)來自菌株NBIC-380的Cry1Ac氨基酸序列的71位和393位都為絲氨酸S，而NBIN-866的都為脯氨酸P，推測這兩個位點的氨基酸的變化可能是影響毒性大小的重要因素。

關鍵詞：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）;Cry1Ac;融合蛋白;玉米螟;活性比較中圖分類號：S188 ? ? ? ? ? ?中圖分類號：S476 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5742-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.029

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）是一種土壤革蘭氏陽性細菌，具有較廣的殺蟲譜。其主要的殺蟲活性物質是殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal protein，ICP）[1]。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等500多種昆蟲及線蟲等原生動物有毒殺活性[2]。目前關于Cry蛋白中Cry1Ac蛋白結構以及功能方面的研究，國內外均有報道，如在Cry1Ac蛋白末端融合其他蛋白以提高殺蟲活性[3-5]或者將另一種蛋白與其一起共表達來提高殺蟲活性[6]。本研究通過克隆表達兩類不同來源的Cry1Ac蛋白，生物測定發(fā)現(xiàn)對玉米螟的殺蟲活性差異較大，從一級結構上分析了可能影響毒性大小的氨基酸位點，為后續(xù)該蛋白質結構的研究提供理論基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

菌種：分離自土壤的兩株含有cry1Ac基因的蘇云金芽胞桿菌菌株NBIC-380和NBIN-866以及大腸桿菌菌株DH5α和BL21保存于湖北省生物農藥工程研究中心;pGEX-6P-1購自Invitrogen公司;T4連接酶、Ex Taq酶、Bam HI、Sal I、Hind Ⅲ、DNA Marker（各條帶大小依次為23 130、9 416、6 557、4 361、2 322、2 027、564 bp）、即用型蛋白質分子量標準（各條帶大小依次為200、116、97.2、66.4、44.3、29.0、20.1、14.3、6.5 kDa）、pMD19-T Simple Vector購自TaKaRa公司;透析袋和透析夾購自伯樂生命醫(yī)學（上海）有限公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;基因組DNA提取試劑盒（樹脂型）購自上海賽百盛基因技術有限公司;細菌蛋白抽提GST瓊脂糖凝膠和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司;其他化學試劑均為分析純。

1.2 ?方法

1.2.1 ?克隆 ?用細菌總基因組提取試劑盒抽提蘇云金芽胞桿菌NBIC-380和NBIN-866的總基因組，對于NBIC-380的Cry1Ac，以菌株NBIC-380總基因組為模板，采用引物Cry1A-F：GGATCCATGGATAACAATCCGAACATC，下劃線處是Bam HI酶切位點和Cry1A-R：GTCGACTACACGAACAATCTAAGTCAG，下劃線處是Sal I酶切位點），在PCR條件（94 ℃、1 min;94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、150 s，25個循環(huán);72 ℃、5min;16 ℃、5 min）下進行PCR擴增，PCR產物命名為2-Cry1Ac;對于菌株NBIN-866的Cry1Ac，以菌株NBIC-866總基因組為模板，采用引物Cry1A-F和Cry1A-R，在PCR條件（94 ℃、1 min;94 ℃、30 s，49 ℃、30 s，72 ℃、150 s，25個循環(huán);72 ℃、5 min;16 ℃、5 min）下進行PCR擴增，PCR產物命名為5-Cry1Ac。將PCR產物割膠，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，先連入pMD19-T Simple Vector進行TA克隆，通過藍白斑篩選、PCR驗證和雙酶切驗證挑選正確的轉化子，送去上海生工生物工程股份有限公司測序，將正確的轉化子通過Bam HI和Sal Ⅰ雙酶切下來連入同樣酶雙酶切處理完全的pGEX-6P-1表達載體，通過PCR和單酶切驗證后將正確的轉化子的質粒轉入宿主菌BL21。

1.2.2 ?融合蛋白表達與純化 ?在28 ℃、IPTG終濃度為0.5 mmol/L、誘導5 h進行重組蛋白的表達，參照北京康為世紀生物科技有限公司細菌GST融合蛋白抽提說明書，采用GST標簽的親和層析純化方法純化融合蛋白，通過SDS-PAGE檢測，將純化的目的條帶較濃雜帶較少的純化液于4 ℃用透析袋透析過夜，透析緩沖液采用1倍的磷酸緩沖液。透析后的蛋白質采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度測定。

1.2.3 ?生測試驗 ?將透析后的蛋白質參照文獻[7]進行玉米螟的室內生物測定試驗。采用LD50數(shù)據處理軟件統(tǒng)計兩種蛋白質的LC50。

2 ?結果與分析

2.1 ?pGEX-6P-1-Cry1Ac原核表達載體的構建結果

通過PCR擴增獲得了2個分別來自Bt NBIC-380和NBIN-866的2.4 kb的cry1Ac基因片段（圖1A），將TA克隆得到的轉化子進行菌落PCR驗證、雙酶切驗證（圖1B）以及測序驗證，結果表明該轉化子是陽性克隆。將陽性克隆重組質粒上兩個基因片段雙切下來連入用相同的酶切過的pGEX-6P-1表達載體上，通過PCR驗證和單酶切驗證（圖1C）表明，2個基因成功地克隆到了pGEX-6P-1表達載體上。

2.2 ?大腸桿菌誘導表達與純化結果

在28 ℃用0.5 mmol/L IPTG誘導5 h，用親和層析法純化得到了融合蛋白（圖2），融合蛋白分子量大小約為118 kDa。用BCA蛋白濃度測定試劑盒對以上純化并透析過的融合蛋白進行濃度測定，帶有GST標簽的2-Cry1Ac和5-Cry1Ac的濃度分別為190 mg/mL和199 μg/mL。

2.3 ?室內生物測定試驗結果

將帶有GST標簽的2-Cry1Ac和5-Cry1Ac稀釋成3個濃度進行玉米螟的室內生物測定試驗，采用LD50數(shù)據處理軟件統(tǒng)計得到兩種蛋白質的LC50分別為15.07和65.39 μg/mL?？梢姡?-Cry1Ac殺玉米螟的活性是5-Cry1Ac的4倍以上。

2.4 ?兩種蛋白質氨基酸序列的比對結果

因為2-Cry1Ac殺玉米螟活性是5-Cry1Ac的4倍以上，采用MegAlign軟件將兩種蛋白質的氨基酸序列進行比對以期找到毒性更高的原因。由圖3可知，在兩種蛋白質的核心功能域[2]里，2-Cry1Ac（來自菌株NBIC-380的Cry1Ac）氨基酸序列的71位為S、393位為S，而5-Cry1Ac（NBIN-866的）分別為P、P，其余序列完全一樣。通過在MMDB數(shù)據庫找到已經報道的Cry1Ac的3D結構（MMDB ID：110041），找到了2-Cry1Ac/5-Cry1Ac氨基酸序列上相應的71位和393位，由圖4可知，兩個氨基酸位點都是突出在蛋白質結構的表面。P和S都是中性氨基酸，不過P是非極性氨基酸，而S是極性氨基酸，這兩個結構域上的71和393位由P變成S后，使蛋白質殺玉米螟的活性提高了3倍多，原因還需要進一步分析。

3 ?小結與討論

從2個來源的Bt NBIC-380和NBIN-866里PCR分別得到了2-Cry1Ac和5-Cry1Ac，將其克隆到pGEX-6P-1表達載體上，然后利用大腸桿菌進行表達，并進行融合蛋白的親和層析柱純化，純化的兩種蛋白質中NBIC-380的2-Cry1Ac殺玉米螟的活性約是NBIN-866的5-Cry1Ac的4倍。分析這兩種蛋白質的氨基酸序列可知，2-Cry1Ac氨基酸序列的71位為S、393位為S，而5-Cry1Ac分別為P、P，其余序列完全一樣。71位氨基酸位于內毒素N內，393位氨基酸位于內毒素M上（http：//www.rcsb.org/pdb/protein/P05068？ evtc= Suggest& evta= UniProtGene%20Names&evtl=OtherOptions），兩個氨基酸位點都是突出在蛋白質結構的表面，P和S都是中性氨基酸，不過P是非極性氨基酸，而S是極性氨基酸，這兩個結構域上的71和393位由P變成S后，使蛋白質殺玉米螟的活性提高了3倍，推測這兩個位點的氨基酸的變化可能是影響毒性大小的重要因素，接下來將針對這兩個氨基酸位點展開進一步研究。

參考文獻：

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[7] 張志剛，楊自文，王開梅，等.新型新殺蟲劑的高通量篩選方法研究[J].湖北農業(yè)科學，2010，49（12）：3045-3048.