李兵，何翠薇，陳青青，梁智

摘要：采用正交試驗優(yōu)化廣西木薯（Manihot esculenta Crantz）葉中總黃酮提取的最佳工藝，并在此條件下提取木薯葉總黃酮進行抗菌性試驗。結果表明，液料比1∶25（V∶m），乙醇體積分數(shù)60%，提取時間100 min的條件下木薯葉中總黃酮含量最高，達到25.23 mg/g;抗菌性試驗表明，木薯葉總黃酮對金黃色葡萄球菌有較高的抑菌作用。

關鍵詞：木薯（Manihot esculenta Crantz）葉;總黃酮;提取;抗菌

中圖分類號：S533 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）23-5816-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.049

木薯（Manihot esculenta Crantz）又叫樹薯、木番薯，地下部結薯，屬于大戟科木薯屬植物[1]。木薯是中國主要的熱帶作物之一，已被確認為廣西重要的非糧食能源作物，其種植面積迅速擴大，成為我國“十一五”重點發(fā)展的產(chǎn)業(yè)之一。然而，大規(guī)模的種植和加工利用產(chǎn)生大量的莖桿和葉等農(nóng)副產(chǎn)品，它們沒有得到充分利用而成為廢棄物，這些廢棄物往往被丟棄或是直接焚燒，既污染了環(huán)境，又浪費了資源。研究表明，食用木薯葉可提高抗病能力，減少患癌癥及糖尿病、高血壓等疾病的幾率[2]?？梢娔臼沓鋲K根部分外，其他沒有充分利用的部分有可能含有有效的藥用成分。研究發(fā)現(xiàn)，木薯葉中含有黃酮類化合物[3，4]，本研究采用正交試驗法研究了廣西木薯葉中黃酮類化合物的提取方法，同時進行了抗菌性研究，為進一步開發(fā)利用木薯葉提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

木薯葉采自廣西桂北地區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學郭敏副教授鑒定為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬木薯（Manihot esculenta Crantz）的葉子，洗凈后經(jīng)50 ℃干燥48 h后粉碎備用。

1.2 ?試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC26003，金黃色葡萄球菌耐藥株（Staphylococcus susceptive strain），宋內(nèi)氏痢疾桿菌（Shigella sonnei），綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853，以上菌株均由廣西中醫(yī)藥大學微生物免疫學教研室提供;營養(yǎng)肉湯（批號20100821）、營養(yǎng)瓊脂（批號201008131）、水解酪蛋白（MH）肉湯（批號201009022）均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;蘆丁對照品（批號100080-200707）購自中國藥品生物制品檢定所。

95%乙醇、H2SO4（批號T20090811）、二甲基亞砜（DMSO，批號T20100126）均購自國藥集團化學試劑有限公司，BaCl2·2H2O（批號20071107）購自廣州新建精細化工廠。

1.3 ?儀器與設備

SHZ-D型循環(huán)水式真空泵，KQ5200B型超聲波清洗器，98-1-B型電子調(diào)溫電熱套立式壓力蒸汽滅菌器，SW-CJ-1F超凈工作臺，BP211D型電子分析天平，游標卡尺（0～200 mm），Agilent 8453型紫外-可見分光光度計。

1.4 ?方法

1.4.1 ?木薯葉總黃酮標準曲線的繪制 ?精確稱取120 ℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標準品5.7 mg，用60%乙醇溶液定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度0.57 mg/mL的標準品溶液。精確吸取上述標準品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，分別加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 mL 60%乙醇溶液，加5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10% Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻，放置6 min，加4% NaOH溶液4 mL，加60%乙醇溶液定容，搖勻放置15 min，在504 nm波長處測定吸光度A，繪制總黃酮質(zhì)量濃度與吸光度的標準曲線[5-7]。

1.4.2 ?總黃酮提取的工藝流程 ?木薯葉碎葉→熱浸提→過濾→提取液→濃縮→干燥→木薯葉總黃酮。

1.4.3 ?單因素試驗 ?分別研究液料比（溶劑體積：原料質(zhì)量，下同）、乙醇體積分數(shù)、提取時間對木薯葉總黃酮含量的影響。

總黃酮含量（mg/g）=■

式中，C表示質(zhì)量濃度（mg/mL），v表示顯色液的體積（mL），V表示乙醇的體積（mL），m表示所用木薯葉的質(zhì)量（g）。

1.4.4 ?正交試驗 ?根據(jù)單因素試驗結果，確定以液料比（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、提取時間（C）為試驗因素，進行正交試驗L9（34）（表1），優(yōu)化木薯葉總黃酮的提取工藝。

1.4.5 ?驗證試驗 ?精確稱取木薯葉粉末2.00 g，在正交試驗所得最佳提取工藝條件下提取木薯葉總黃酮，計算總黃酮含量。

1.4.6 ?木薯葉總黃酮的抗菌性測定

1）培養(yǎng)基的制備：將營養(yǎng)瓊脂33 g加入1 000 mL去離子水中，加熱溶解并調(diào)節(jié)pH為7.4～7.6，于0.15 MPa下高壓滅菌25 min。

2）菌液的制備：金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、宋內(nèi)氏痢疾桿菌和綠膿桿菌使用前用接種環(huán)分別取新鮮菌苔接種于瓊脂培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，將經(jīng)培養(yǎng)基傳代的各菌種于試管壁上研磨并溶于2 mL滅菌注射用水中，配制成1×108 CFU/mL菌液備用。

3）抗菌性供試液制備：在優(yōu)化工藝條件下提取的木薯葉總黃酮提取液，用乙酸乙酯萃取后濃縮制成稠膏，取木薯葉乙酸乙酯稠膏0.1 g，精確稱量，用已滅菌注射用水溶解，加入適量滅菌二甲基亞砜（DMSO）助溶，配制成0.1 g/mL的木薯葉總黃酮乙酸乙酯萃取藥液。

4）瓊脂平板打孔法測定抗菌活性：于直徑9 cm的無菌平皿內(nèi)加入30 mL熔化的滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，使其厚度約為0.5 cm，待其冷卻凝固后作為底層;再取熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL，鋪在底層之上，冷卻凝固后作為上層。用直徑為5 mm滅菌不銹鋼打孔器在瓊脂平板上均勻且垂直打5個孔。將100 μL供試驗菌液均勻地涂布于瓊脂平板的表面。用移液器吸取木薯葉總黃酮乙酸乙酯萃取藥液約50 μL加入到各瓊脂孔內(nèi)，并用30 %二甲基亞砜（DMSO）無菌溶液作為空白對照，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h。觀察孔周圍有無抑菌圈，并以游標卡尺測量抑菌圈兩個垂直方向的直徑（扣除孔徑5 mm），取其平均值作為測定結果[8，9]。

2 ?結果與分析

2.1 ?木薯葉總黃酮標準曲線的繪制

在504 nm處，分別測出6 個標準溶液的吸光度，并對吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的關系作圖，如圖1所示，通過線性回歸，得到方程為A=11.774×C+0.063 5，R2=0.987，其中A為吸光度，C為總黃酮的質(zhì)量濃度。結果表明，在蘆丁質(zhì)量濃度為0.028 6～0.109 4 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 ?單因素試驗結果

2.2.1 ?液料比對木薯葉總黃酮含量的影響 ?在乙醇體積分數(shù)80%、提取時間60 min的條件下，研究液料比對木薯葉中總黃酮含量的影響。結果表明（圖2），在1∶40范圍內(nèi)，隨著溶劑量的增加，總黃酮含量明顯升高。在實際操作中，考慮總黃酮的充分溶出同時也避免溶劑的浪費，正交試驗設計中液料比設置為1∶10、1∶25、1∶40（mL∶g）。

2.2.2 ?乙醇體積分數(shù)對木薯葉總黃酮含量的影響在液料比1∶20、提取時間80 min條件下，研究乙醇體積分數(shù)對木薯葉中總黃酮含量的影響。結果表明（圖3），當乙醇體積分數(shù)大于40%時，總黃酮含量隨著乙醇體積分數(shù)的增大而升高，但乙醇體積分數(shù)太高提取的色素等雜質(zhì)量也增加，故在正交試驗設計中乙醇體積分數(shù)設置為40%、60%、80%。

2.2.3 ?提取時間對木薯葉總黃酮含量的影響 ?在乙醇體積分數(shù)60%、液料比1∶20條件下，研究提取時間30、40、80、100、120 min對木薯葉中總黃酮含量的影響。結果表明（圖4），木薯葉黃酮提取率隨提取時間的延長而升高，當提取時間大于100 min 后總黃酮含量開始下降。在選擇提取時間時既要考慮有效物質(zhì)是否充分溶出，也要注意過長時間的高溫提取對化合物結構的影響，故正交試驗設計中提取時間設置為40、70、100 min。

2.3 ?正交試驗結果

從表2、3可以看出，影響木薯葉總黃酮含量的3個因素大小順序為液料比、乙醇體積分數(shù)、提取時間，液料比對木薯葉總黃酮含量的影響較顯著，乙醇體積分數(shù)、提取時間對木薯葉總黃酮含量的影響不大。得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比1∶25，乙醇體積分數(shù)60%，提取時間100 min。

2.4 ?驗證試驗

為驗證優(yōu)選工藝的可靠性，取3份木薯葉碎葉，每份2.00 g，按上述最優(yōu)工藝條件進行驗證試驗，測得總黃酮含量為25.23 mg/g，RSD為3.0%。

2.5 ?木薯葉總黃酮的抗菌性測定結果

木薯葉乙酸乙酯萃取部位抗菌試驗結果見表4。由表4可見，木薯葉乙酸乙酯萃取藥液對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株均有明顯的抑菌作用，對宋內(nèi)氏痢疾桿菌、綠膿桿菌的生長亦有一定抑菌作用。4種菌種的抑菌圈直徑分別為16.58、11.02、5.48、4.22 mm;抑菌效果為：金黃色葡萄球菌>金黃色葡萄球菌耐藥株>宋內(nèi)氏痢疾桿菌>綠膿桿菌，其中對金黃色葡萄球菌為高敏感。

3 ?結論

本試驗以乙醇為溶劑，以廣西木薯葉總黃酮含量為考察指標，通過對液料比、乙醇體積分數(shù)、回流時間進行單因素試驗和正交試驗，優(yōu)選出廣西木薯葉總黃酮的最佳提取工藝為液料比1∶25，乙醇體積分數(shù)60%，提取時間100 min。該工藝操作簡便、成本低、收率高，具有良好的穩(wěn)定性，可為廣西木薯葉總黃酮的生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

抗菌試驗結果表明，木薯葉乙酸乙酯萃取藥液對金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、綠膿桿菌4種菌種均有抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最為明顯，表明木薯葉乙酸乙酯萃取藥液具有抑菌活性成分，以對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，可為進一步研究木薯葉的抑菌活性提供參考。

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