聶文波　汪明星　張振華　孫付杰

密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

聶文波1汪明星2張振華1孫付杰1

【摘要】目的 通過(guò)密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法體外分離、培養(yǎng)、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。方法 采用密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法，對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外分離后傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)。結(jié)果 P3代大鼠BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)5天，CD29、CD90、CD34陽(yáng)性率分別為94.27%、91.16%、1.72%。結(jié)論 密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法成功分離培養(yǎng)了高純度、高活性、生物學(xué)形態(tài)和特征穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；貼壁法篩選法；細(xì)胞培養(yǎng)

作者單位：1 274300 山東省菏澤市單縣中心醫(yī)院脊柱外科；2 221006徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院

間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）來(lái)源于早期發(fā)育的胚層，在人體各器官組織內(nèi)分布相當(dāng)廣泛，被稱為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[1]。BMSCs作為一種多功能肝細(xì)胞，能在合適的前提下分化為：骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等等。而B(niǎo)MSCs，來(lái)源豐富，同時(shí)還具備取材方便的優(yōu)點(diǎn)，因此非常適合進(jìn)行體外培養(yǎng)，簡(jiǎn)單有效、增值速度相當(dāng)快，同時(shí)還可避免概念上的歧義，因此BMSCs廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域，被學(xué)術(shù)界稱為織工程種子的最佳組細(xì)胞來(lái)源。本次研究應(yīng)用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，為進(jìn)一步試驗(yàn)提供細(xì)胞基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要試驗(yàn)材料及設(shè)備

SD大鼠，4周齡，體重120～200 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；胎牛血清（FBS），塞默飛世爾生物公司；DMEM/F-12培養(yǎng)基，塞默飛世爾生物公司；胰蛋白酶，Beyotime公司生產(chǎn)；Percoll分離液，上海Rego公司；恒溫箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械；5%CO2培養(yǎng)箱， Thermo電器公司；離心機(jī)，eppendorf公司；倒置相差顯微鏡，COIC公司；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.2方法

BMSCs的分離、培養(yǎng)及傳代、擴(kuò)增：大白鼠處死后體積分?jǐn)?shù)控制在75%，在乙醇中浸泡5 min，采用無(wú)菌操作分離大鼠股骨、脛骨，清除附著的肌肉組織，暴露骨髓腔并用PBS反復(fù)沖洗，收集細(xì)胞沖洗液并過(guò)篩網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，離心收集骨髓細(xì)胞，對(duì)管內(nèi)細(xì)胞用含有10%FBS的DMEM/F-12的培養(yǎng)基，進(jìn)行懸浮離心操作，并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞密度控制在2×106/ml，在25 cm2的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行接種。原代接種后，靜置培養(yǎng)，24 h后首次全量換液，之后每3 d全量換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化與傳代培養(yǎng)（按1：3的比例）[2]。

BMSCs的形態(tài)觀察學(xué)：對(duì)原代、傳代培養(yǎng)的BMSCs，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，主要內(nèi)容包括細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，頻率為1次/d。

流式細(xì)胞儀法鑒定BMSCs分子表面標(biāo)志：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P3代細(xì)胞，胰酶消化、多聚甲醛固定后分為三管，分別加入稀釋的單克隆抗體（FITC標(biāo)記CD29、CD90；單克隆抗體、PE標(biāo)記CD34），充分混合后在室溫條件下避光孵育20min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)志，使用儀器自帶軟件記錄、分析并導(dǎo)出結(jié)果[3]。

2　結(jié)果

2.1BMSCSs的形態(tài)學(xué)觀察

接種24 h之后，后貼壁細(xì)胞與細(xì)胞貼壁增多現(xiàn)象明顯，倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)主要包括圓形和橢圓形。貼壁細(xì)胞形狀呈長(zhǎng)梭形，未貼壁細(xì)胞形態(tài)圓且亮。2 d之后，貼壁細(xì)胞明顯增多、并有二角形、多邊形或者不規(guī)則形狀細(xì)胞出現(xiàn)，貼壁細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)。5 d之后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，呈大條的纖維狀，大量細(xì)胞呈外放射狀向外生長(zhǎng)，細(xì)胞排列工整。原代培養(yǎng)7～9 d左右細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%，鋪滿瓶底，有傳代能力。剛傳代的細(xì)胞呈圓形，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，接種2～4 h后在倒置相差顯微鏡下即可發(fā)現(xiàn)有貼壁，細(xì)胞伸展生長(zhǎng)，呈放射狀或不規(guī)則狀生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多樣，大部分為梭形；另一種形態(tài)為寬闊扁平狀，形態(tài)各異，細(xì)胞核為圓形或橢圓形，長(zhǎng)滿后出現(xiàn)抑制且停止增殖。細(xì)胞培養(yǎng)至第三代時(shí)，倒置相差顯微鏡下觀察5 d即可達(dá)到80%～90%融合。

2.2SD大鼠BMSCs表面抗原鑒定

P3代大鼠BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)5天，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD29、CD90、CD34陽(yáng)性率分別為94.27%、91.16%、1.72%。

3　討論

BMSCs的抗原表型具有多樣化特征，同時(shí)具備間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與肌細(xì)胞的特征，無(wú)特異性標(biāo)志。BMSCs與造血細(xì)胞共存于骨髓中，據(jù)文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)解釋：BMSCs表面抗原主要有：CD90、CD105、CD29、SH-3、SH-4 CD44、CD71、CD106、SB-10等陽(yáng)性表面抗原；另外，造血細(xì)胞不表達(dá)表面抗原的有：CD45（白細(xì)胞標(biāo)志抗原），CD11（淋巴細(xì)胞表面抗原）與CD34（造血前體細(xì)胞抗源）。

綜上所述，用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)的BMSCs，純度較高，并可以快速擴(kuò)增并分化，細(xì)胞表型鑒定CD29、CD90陽(yáng)性、CD34陰性，是細(xì)胞移植的理想種子細(xì)胞，有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳國(guó)平，滕利，楊鍇，等. 密度梯度離心并貼壁法分離成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨特性[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(7)：1209-1212，1401.

[2] 曾瑞霞，單偉，房艷，等. 密度梯度離心法結(jié)合貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[J]. 解剖科學(xué)進(jìn)展，2012，18(5)：438-441.

[3] 付文玉，路艷蒙，樸英杰. 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化與端粒酶活性[J]. 第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，21(11)：801-804.

Biological Characteristics of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Isolated by Density Gradient Centrifugation Combined With Adherence Screening Method

NIE Wenbo1WANG Mingxing2ZHANG Zhenhua1SUN Fujie1, 1 Spine Surgery, Center Hospital of Shandong Heze Shanxian County, Heze 274300, China, 2 the Second Hospital Affiliated to Xuzhou Medical College, Xuzhou 221006, China

[Abstract] Objective To evaluate the biological characteristics, phenotype of bone marrow mesenchymaI stem cells that are isolated. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, purified and cultured by the whole bone marrow adherence method. Morphological observation and flow cytometry determination of celI surface markers were performed., Results The positive rates of BMSCs, CD34 and CD29 were 5, 91.16% and 94.27% in P3 cells cultured in CD90 generation. Conclusion The whole bone marrow adherence method is easy to operate, and can be used to harvest high-purification bone marrow mesenchymal stem cells with high cell viability and diferentiation ability.

[Key words]The whole bone marrow adherence method, Mesenchymal stern cells, Cultured

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.21.051

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）21-0069-02

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R361