楊德敏 劉良波
摘要:為建立動物組織中氯霉素殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,以氯霉素-D5為內(nèi)標(biāo),乙腈和4% NaCl溶液渦旋振蕩提取動物組織中氯霉素,正己烷除去脂溶性雜質(zhì),再用水飽和乙酸乙酯液液萃取, 濃縮后HLB小柱凈化,甲醇:水(50:50)定容,HPLC-MS/MS測定。采用電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式檢測,用氯霉素-D5作內(nèi)標(biāo)來定量。 結(jié)果表明,氯霉素檢測的線性范圍為0.5~10.0 μg/kg,r2=0.999 1,加標(biāo)水平為0.2、0.4、1.0μg/kg時(shí),平均回收率72.40%~114.20%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%,氯霉素的定量檢測下限為0.2μg/kg 。說明該方法基質(zhì)影響小,檢測靈敏度高,檢測結(jié)果準(zhǔn)確,回收率好,適用于動物組織中氯霉素殘留的檢測。
關(guān)鍵詞:液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS);動物組織;氯霉素;殘留
中圖分類號:R978.1+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1007-273X(2014)11-0014-02
氯霉素(Chloramphenicol)屬廣譜抗生素,曾在畜牧業(yè)中廣為應(yīng)用,但在動物可食組織中的殘留會通過食物鏈傳給人類,長期微量攝入,不僅使人體腸道正常菌群失調(diào)[1],而且還會抑制人體骨髓造血功能導(dǎo)致引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[2]。氯霉素殘留問題已引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視,歐盟、美國等均在法規(guī)中規(guī)定氯霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”,即不得檢出。近年來,我國出口到歐盟、美國等地區(qū)的畜禽、水產(chǎn)品等多次因?yàn)槁让顾爻瑯?biāo)被限制,損失達(dá)到數(shù)十億美元。我國禁止使用氯霉素,但仍存在用氯霉素治療畜禽、水產(chǎn)品疾病的現(xiàn)象。
目前國內(nèi)外對氯霉素殘留的研究集中在畜禽肌肉、水產(chǎn)品、蝦及牛奶等的測定[3-6],常用的檢測方法包括氣相色譜法、高效液相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等,現(xiàn)在多采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC-MS/MS)。為了保障我國人民的健康及擴(kuò)大動物性食品的貿(mào)易往來,有必要建立動物組織中氯霉素殘留量專屬、靈敏、定性、定量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法。
1 材料與方法
1.1 樣品制備
畜禽肉類,取可食用肌肉組織;畜禽肝臟可取整塊;水產(chǎn)品類去皮后,取魚肉部分,用高速勻漿機(jī)將其均質(zhì)。
1.2 儀器和試劑
儀器:液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀Quattro Premier XE(美國Waters公司);去離子水發(fā)生器;TL-18M型高速冷凍離心機(jī);BS210S型電子天平(北京startorius公司);OA-SYS型恒溫水浴氮吹濃縮儀;MS1/MS2型渦旋振蕩器;S180H型超聲波。
試劑:所用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲醇均為進(jìn)口色譜純;水為去離子水; 氯化鈉為分析純,4% NaCl溶液臨用前配制;水飽和乙酸乙酯用50 mL水加400 mL乙酸乙酯超聲30 min,靜置分層后取上層乙酸乙酯用。
1.3 HPLC色譜條件
Waters超高效液相色譜柱 (WATERS ACQUITY UPLC?BEH C18柱50×2.1mm,1.7μm);流動相:甲醇:水(50:50),用前過0.20 μm濾膜,除雜脫氣;柱溫:40 ℃;流速:0.25 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;運(yùn)行時(shí)間1.5 min。
1.4 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電離電壓:2.8 kV;碰撞氣:氬氣3.0×10-3mbar;脫溶劑氣速:500 L/hr;錐孔氣速:20 L/hr。數(shù)據(jù)采集窗口:1.5 min;駐留時(shí)間:0.6 s。離子化模式:ESI-;質(zhì)譜分辨率:單位分辨率;離子化溫度:350 ℃;離子源溫度:110 ℃。定性、定量離子及對應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見表1。
1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,置于100 mL容量瓶中,用甲醇超聲溶解,再用甲醇稀釋為1.0 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液,再將其用流動相(甲醇:水=50:50)稀釋為濃度0.5、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列,均含內(nèi)標(biāo)4 ng/mL。
內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱量氯霉素-D5,用甲醇超聲溶解為100 μg/mL的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液,將其用流動相稀釋為濃度40 ng/mL的使用液。
1.6 樣品處理
稱取5.00 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入100 μL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用液(40 ng/mL),加入5 mL乙腈和5 mL 4% NaCl溶液渦旋振蕩2 min,4 000 r/min離心5 min,取上清液至另一50 mL離心管中,殘?jiān)貜?fù)提取一次,合并上清液。加入5 mL正己烷脫脂凈化兩次,棄去正己烷層,水層用5mL水飽和乙酸乙酯提取兩次,然后合并乙酸乙酯層在50 ℃下氮吹濃縮至干,加入1 mL甲醇渦旋1 min溶解待測物,加水至20 mL超聲3 min混勻。依次用5 mL甲醇、5 mL水活化Oasis HLB(6cc 200 mg),20 mL待測物過柱,再用5 mL水洗柱子,抽干柱子后用6 mL甲醇洗脫接收,將接收液在50 ℃下氮吹濃縮至干,準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇:水 (50:50),旋渦振蕩30 s后超聲2 min,過0.20μm 微孔濾膜后上HPLC-MS/MS分析。
1.7 樣品加標(biāo)試驗(yàn)
稱取5.00 g不同類別陰性樣品后,分別添加為氯霉素濃度0.2、0.4、1.0 μg/kg 的陽性樣品,加入100 μL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用液(40 ng/mL),室溫下放置20~30 min后進(jìn)行樣品處理后上機(jī)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 線性范圍
配制濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列,均含內(nèi)標(biāo)4 ng/mL。以質(zhì)量濃度x(ng/mL)為橫坐標(biāo),峰面積的比值y(氯霉素峰面積/氯霉素-D5峰面積)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為y = 0.220 312x ±0.033 617 3,r2 = 0.999 1。結(jié)果表明,氯霉素在0.5~10.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)
分別稱取禽類、豬肉、豬肝、水產(chǎn)品類陰性樣品5.00 g,每類都添加氯霉素0.2、0.4、1.0 μg/kg,每個(gè)濃度水平取6個(gè)平行樣,加入100 μL氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)使用液(40 ng/mL),加標(biāo)樣品的回收率為72.40%~114.20%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%(表2),氯霉素-D5的回收率為82.9%~102.5%。
2.3 定量檢測下限
樣品中添加濃度為0.2 μg/kg時(shí),定量離子信噪比S/N為10.51,回收率為72.40~108.60%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%,因此方法定量檢測下限為0.2 μg/kg。
2.4 樣品的測定
抽取市場中畜禽產(chǎn)品53批,水產(chǎn)品60批,其中雞肉在一批樣品中檢出有氯霉素殘留樣品一批,其殘留量為0.35 μg/kg。
3 討論
3.1 提取溶液的選擇
氯霉素為中性化合物,可以用甲醇、乙腈、丙酮、和乙酸乙酯等溶劑提取,乙酸乙酯提取效率高但與水不互溶,當(dāng)樣品為干粉類含水量較少的動物組織時(shí),提取效率明顯降低。用乙腈加入4% NaCl溶液對各類干、濕動物組織樣品中的氯霉素殘留都有較高的提取效率,且加入4% NaCl溶液后能有效的降低提取物中蛋白質(zhì)和油脂的含量,利于凈化。
3.2 提取方式的選擇
樣品提取時(shí),渦旋振蕩、超聲或者振蕩提取都可以,但超聲或振蕩的時(shí)間要10 min,而渦旋振蕩只2 min。樣品批量少時(shí)可以選擇渦旋振蕩,批量多時(shí)可以選擇超聲或者振蕩,能夠大批量放入同時(shí)提取。
3.3 流動相的選擇
有報(bào)道指出在負(fù)離子模式下用乙腈代替流動相中的甲醇會增強(qiáng)信號強(qiáng)度[10]。試驗(yàn)以乙腈:水(50:50)作為流動相,未觀察到靈敏度的顯著提高。而以甲醇:水(50:50)作為流動相,靈敏度已滿足要求而且出峰時(shí)間縮短,提高檢測效率。
4 結(jié)論
本方法受基質(zhì)影響小,檢測靈敏度高,檢測結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,適用于各類干、濕動物組織中氯霉素殘留的檢測。
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