蔡 蘇 亞

（陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息工程學(xué)院, 陜西 咸陽 712000）

基于數(shù)據(jù)庫分析的增強(qiáng)型熒光探針研究

蔡 蘇 亞

（陜西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息工程學(xué)院, 陜西 咸陽 712000）

汞離子在我們生活中的應(yīng)用較廣,它的腐蝕性和致癌性較強(qiáng)。基于增強(qiáng)型熒光探針設(shè)計進(jìn)行了分子檢測實驗研究，數(shù)據(jù)庫分析表明∶探針熒光的發(fā)射強(qiáng)度隨汞離子的增加而變強(qiáng)； pH在4.00～7.00之間，pH值不會干擾化合物1對Hg2+的檢測。結(jié)果表明：汞離子探針的高靈敏度和良好的選擇性，對測定自來水和院校初級水中的汞離子濃度起到了作用，對于熒光探針的進(jìn)一步改進(jìn)具有參考價值。

探針熒光；汞離子；發(fā)射強(qiáng)度；pH值

探針不是一種檢測工具，而是一種檢測分子，該分析可以在保證被檢測對象不產(chǎn)生或只產(chǎn)生可忽略的干擾的情況下，通過和某特異靶分子相互作用來檢測靶分子。顧名思義，熒光探針是一種存在熒光物質(zhì)的分子，這種熒光探針可以作為一種指示劑,通過一定的光的刺激使指示劑發(fā)光從而對被檢測對象進(jìn)行定性或定量分析[1]。熒光分析方法具有很大的優(yōu)勢，如較高的靈敏度,較好的選擇性,所需要的樣本比較少，通常主要應(yīng)用在分析化學(xué)領(lǐng)域,如分子生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)等。但是自然界中的大量的生物分子本身不存在或存在較少的熒光物質(zhì),這就影響了檢測工作的進(jìn)行。因此人們采用熒光探針技術(shù)促進(jìn)檢測工作的順利進(jìn)行，熒光探針技術(shù)是通過能夠使被檢測對象產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的方法增強(qiáng)熒光檢測試驗的，其方法是在被檢測對象中加入強(qiáng)熒光的標(biāo)記試劑、熒光生成試劑等，生成高熒光強(qiáng)度的共價或非共價結(jié)合的物質(zhì)。汞是存在于自然界中的一種重金屬元素，它的存在形式多種多樣，有游離態(tài)、無機(jī)和有機(jī)汞三種狀態(tài)[2]。相對于亞汞離子（Hg+），汞離子（Hg2+）在我們生活中的應(yīng)用較廣，它的腐蝕性和致癌性很強(qiáng)，具有破壞性。有機(jī)汞（尤其是甲基汞）一般通過海洋生物進(jìn)入人體，這種物質(zhì)一旦進(jìn)入人體就會對大腦造成傷害，甚至還會出現(xiàn)其他的慢性疾病，日本就曾發(fā)生過因有機(jī)汞而造成大量的人感染水俁病。所以，檢測汞離子在水中的含量是關(guān)系人身安全的重要舉措[3,4]。檢測汞離子的方法多種多樣，包括原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法、電化學(xué)方法以及紫外可見光譜法等[5]。但是這些檢測方法都存在很大的缺陷，成本高，樣本提取難度大，耗費(fèi)時間長，不能進(jìn)行實時和現(xiàn)場檢測等?，F(xiàn)在隨著熒光探針的普遍應(yīng)用，檢測汞離子主要采用熒光探針的方法。

1 實驗原理

FQ-PCR就是應(yīng)用熒光探針的方法進(jìn)行的，它巧妙地利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，將熒光探針加入到PCR反應(yīng)系統(tǒng)中，使該探針和DNA模板發(fā)生作用，進(jìn)行特異性雜交，從而使探針的5’端和3’端組成一個能夠進(jìn)行能量傳遞的結(jié)構(gòu)，其中熒光報告基團(tuán)FAM存在于探針的5’端，熒光淬滅基團(tuán)TAMRA存在于探針的3’端。在探針完整的情況下，如果熒光淬滅基團(tuán)TAMRA吸收了熒光報告基團(tuán)FAM所激發(fā)出的熒光信號，那么熒光信號會保持不變。PCR反應(yīng)體系中有些基因會增加特異核酸片段，如目的基因，這些特異核酸片段會根據(jù)堿基配對的原則與熒光探針融合在一起。在復(fù)制過程中，Tap酶會沿著DNA模板從引物3’端移動到探針結(jié)合處，移動期間，5’→ 3’端外切酶活性會將探針割裂，這就是切口平移效應(yīng)。這就會損壞熒光報告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)間的能量傳遞結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致淬滅基團(tuán)失去淬滅作用，熒光報告基團(tuán)失去標(biāo)記作用，熒光信號被釋放到PCR系統(tǒng)外（圖1）。通過觀察PCR的反應(yīng)，我們可以發(fā)現(xiàn)探針隨著特異核酸片段的復(fù)制逐漸被切斷，熒光信號也就相應(yīng)地失去標(biāo)記作用，三者是1∶1∶1的比例變化的。因為被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PRC產(chǎn)物的數(shù)目相等，所以熒光信號與擴(kuò)增產(chǎn)物有很大的關(guān)系。另外，因為熒光信號可以將擴(kuò)增產(chǎn)物的變化表現(xiàn)出來，所以即使不進(jìn)行信號分離也可以完成儀器實時檢測，從而為證明新的PCR定量原理奠定基礎(chǔ)。

圖1 化學(xué)反應(yīng)模式Fig.1 Chemical reaction mode

2 實驗部分

2.1 實驗設(shè)備

通常情況下，熒光測定需要熒光光譜儀，能夠進(jìn)行該操作的工具時 Perkin Elmer LS55 熒光光譜儀，其配置為10.0 nm的激發(fā)狹縫,10.0 nm的發(fā)射狹縫；UV-2450紫外儀可以測定出紫外可見光譜；Varian INOVA-400光譜儀可以測定出核磁共振譜。

為了更好的進(jìn)行實驗研究，羅丹明在Alfa Aesar公司購買了一些材料，如2-氨乙基噻吩、2-氯-1-甲基碘化吡啶和4-二甲氨基吡啶等。因為大多數(shù)的化學(xué)藥品是分析純試劑，所以直接使用是可以的。而且實驗中的水也都是可以進(jìn)行實驗的去離子水。其中實驗中的水所在院校所河水，這種水只是進(jìn)行了初級的過濾；自來水則是沒有經(jīng)過過濾的取自于2006年12月17湖南大學(xué)學(xué)生8舍自來水。

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 熒光發(fā)射光譜圖

圖2是在水溫為25 ℃的條件下，記錄探針1在乙腈和水的體積比為 1∶1的 0.05 mol/L Tris-HNO3，酸堿性為6的緩沖溶液中，熒光發(fā)射光譜隨Hg2+溶液濃度不斷變化的圖。

圖2 熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence emission spectra

圖2顯示，當(dāng)溶液中不存在Hg2+時，580 nm的位置出現(xiàn)一個不太明顯的熒光發(fā)射峰，它代表化合物1的變化；隨著Hg2+的添加，該處的變大，與此同時，Hg2+濃度的增加會使得熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最大峰值。如果Hg2+的濃度超過最大值，化合物1在原來位置的熒光發(fā)射強(qiáng)度會達(dá)到原來的 14.5倍。Hg2+濃度的不斷增加，熒光發(fā)射強(qiáng)度也不斷擴(kuò)大，說明在這個過程中化合物1與Hg2+發(fā)射了反應(yīng)，這是本文測定Hg2+的含量的主要方法。

圖3是探針1是有無Hg2+的紫外可見吸收光譜圖。

圖3 Hg2+離子的光譜圖Fig.3 Hg2+ion spectra

圖中顯示不加入Hg2+時，在560 nm位置是化合物1出現(xiàn)不太明顯的吸收峰，此時化合物1是羅內(nèi)酰胺[274]；如果溶液中汞離子濃度為 10-5mol/L Hg2+，在560 nm的位置，化合物1的吸收峰變大，此時化合物1的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)不存在了。從光譜中可以看出，化合物1中的羅內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被打開是因為Hg2+能和化合物1作用的結(jié)果。

2.2.2 pH的影響

圖4的因變量是pH值，自變量是汞離子濃度為1.0×10-5mol/L時，化合物1熒光強(qiáng)度的變化。

圖4 pH值的變化特性Fig.4 pH change characteristic value

從圖中可以得出以下結(jié)論，Hg2+影響化合物1的熒光強(qiáng)度，如果不加入Hg2+在，其pH 處于4.00到12.00范圍內(nèi)；在溶液中的pH小于4.00的情況下，如果pH減小，熒光強(qiáng)度增加，這是因為強(qiáng)酸性的環(huán)境使得化合物1的羅內(nèi)酰胺被打開，從而增強(qiáng)其熒光度。如果加入Hg2+使其濃度保持在1.0×10-5mol/L 時，化合物1的熒光強(qiáng)度會固定在pH 4.00～7.00范圍內(nèi)；在溶液中的pH大于7.00小于8.00的情況下，如果pH增加，熒光強(qiáng)度減小，這是因為堿性環(huán)境下，Hg2+發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，生成Hg(OH)2，減少了Hg2+，從而減少了與化合物1的反應(yīng)；在溶液中的pH處于8.00～12.00范圍內(nèi)時，熒光強(qiáng)度不會再增加，而且其強(qiáng)度與不存在Hg2+時是一致的。因此，如果pH在4.00～7.00之間，pH值不會干擾化合物1對Hg2+的檢測。從以上分析可知，Tris-HNO3在pH為 6.00的條件下，實驗效果最佳。

3 結(jié) 論

這篇文章中的熒光探針是由汞離子和羅丹明－噻吩類化合物組合而成，實驗中探針熒光的發(fā)射強(qiáng)度歲汞離子的增加而變強(qiáng)，溶液的顏色也逐漸由無色變成粉紅色，這就促進(jìn)了Hg2+的識別。但是只有Hg2+的濃度在5×10-8～1×10-5mol/L之間時，探針才有反應(yīng)，其能夠檢測到的最低值是2.0×10-8mol/L，溶液的酸堿性也在4.0到7.之間0。由于汞離子探針的高靈敏度和良好的選擇性，對測定自來水和院校初級水中的汞離子濃度起到了很大的作用。

［1］龔毅君, 張曉兵, 譚蔚泓,等. 結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計用于構(gòu)建高效Hg2＋熒光探針[J]. 化學(xué)傳感器, 2012, 32(1)∶ 36-36.

［2］李靜, 朱成成, 何衛(wèi)江, 等. 一個基于NBD-NH2熒光團(tuán)的增強(qiáng)型pH熒光探針及其細(xì)胞造影研究[J].無機(jī)化學(xué)學(xué)報, 2013, 29(12)∶2528-2534.

［3］王維娜, 鄭元梅, 陳雪梅, 等. 一種基于DPA識別基團(tuán)的可視化檢測鋅離子的熒光增強(qiáng)型探針[J].無機(jī)化學(xué)學(xué)報, 2014, 30(4)∶872-878.

［4］袁躍華, 馮鋒, 田茂忠, 等. 羅丹明類熒光探針的合成及對銅離子的檢測[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報, 2011, 32(1)∶ 62-66.

［5］李宏林, 樊江莉, 劉曉健, 等. 羅丹明類鈀離子熒光分子探針[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報, 2010, 31(9)∶ 1725-1728.

Study on Enhanced Fluorescent Probes Based on the Database Analysis

CAI Su-ya
（College of Information Engineering ,Shaanxi Polytechnic Institute, Shaanxi Xianyang 712000，China）

Mercury ions have been widely used in our lives, but it has strong corrosion and carcinogenicity. In this paper, enhanced fluorescent probes were designed based on experimental studies of molecular detection. The database analysis shows that, the fluorescence emission intensity of the probe becomes strong with the mercury ions increasing; when pH is between 4.00～7.00, pH value of compound 1 does not interfere with the detection of Hg2+. The above results show that: the mercury ion probes have high sensitivity and good selectivity, it can be used to measure the concentration of mercury ions in water tap .

Fluorescence probe; Mercury ions; Emission intensity; PH value

TQ 028

A

1671-0460（2015）09-2143-03

2015-03-17

蔡蘇亞（1979-），女，陜西岐山人，講師，研究方向：計算機(jī)應(yīng)用。E-mail：caisuya@126.com。