楊雪梅，班小軍, 楊海紅, 范瀟予

（1.甘肅省金昌市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 金昌 737100；2.甘肅省張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 張掖 734000；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110013）

·藥學(xué)研究·
PHARMACEUTICAL RESEARCH

多波長HPLC梯度洗脫法同時(shí)測定保安萬靈丹中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的含量

楊雪梅1，班小軍2*, 楊海紅1, 范瀟予3

（1.甘肅省金昌市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 金昌 737100；2.甘肅省張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 張掖 734000；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110013）

目的：建立同時(shí)測定保安萬靈丹中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素含量的方法。方法：采用多波長HPLC梯度洗脫法：色譜柱為C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈（2∶ 1），流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，流速為1.0 mL · min-1；進(jìn)樣量為20 μL；檢測波長分別為254 nm（用于升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷）、203 nm（用于茅術(shù)醇和β-桉葉醇）和340 nm（用于蒼術(shù)素）。結(jié)果：升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的線性范圍分別為4.30～86.00 mg · L-1（r=0.999 4）、5.85～117.00 mg · L-1（r=0.999 7）、16.42～328.40 mg · L-1（r=0.999 3）、15.16～303.20 mg · L-1（r=0.999 9）和12.78～255.60 mg · L-1（r=0.999 5）；精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)中所測各目標(biāo)組分峰面積的RSD均小于2.0%；升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的平均加樣回收率/RSD(n=6)分別為97.49%/1.45%、96.81%/0.94%、98.60%/1.65%、97.96%/1.38%和99.22%/1.24%。結(jié)論：本法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用作保安萬靈丹的質(zhì)量控制方法。

保安萬靈丹；升麻素苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷；茅術(shù)醇；β-桉葉醇；蒼術(shù)素；含量測定

保安萬靈丹收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第7冊》中[1]，由防風(fēng)、蒼術(shù)、荊芥、羌活、麻黃、細(xì)辛、川芎、制川烏、制草烏、天麻、當(dāng)歸、甘草、石斛、制何首、全蝎、雄黃、朱砂等17味中藥組成，具有解毒消癰、舒筋活血、祛風(fēng)止痛等作用，臨床上用于治療癰疽發(fā)背、深部膿瘍、風(fēng)寒濕痹、肢體癱瘓、偏正頭痛、疝墜痛等癥狀。防風(fēng)和蒼術(shù)為方中的主要藥物，而升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷為防風(fēng)的主要成分，茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素則為蒼術(shù)的主要成分[2]。保安萬靈丹的原部頒標(biāo)準(zhǔn)未要求對方中的任何藥物進(jìn)行定性或定量測定，這樣難以保證對產(chǎn)品質(zhì)量和療效的有效控制。鑒于此，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用多波長HPLC梯度洗脫法同時(shí)對保安萬靈丹中防風(fēng)所含升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷以及蒼術(shù)所含茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素等組分進(jìn)行含量測定，為該藥品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵、G1330B自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫器、G1322A脫氣機(jī)、G1315B可變波長檢測器以及Chemstation色譜工作站；VS-100UE恒溫超聲波提取機(jī)（無錫沃信儀器有限公司）。

保安萬靈丹樣品（每丸質(zhì)量：7.5 g，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào)：4015311、3015814、3015770）。升麻素苷對照品（純度：95.0%，批號(hào)：111522-201310），5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（純度：96.4%，批號(hào)：111523-201208），蒼術(shù)素（純度：99.7 %，批號(hào)：111924-201404），均購于中國食品藥品檢定研究院；茅術(shù)醇（純度：98.0%，批號(hào)：23811-08-7），β-桉葉醇（純度：98.0%，批號(hào)：51317-08-9），均購于上海士鋒生物科技有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈（2∶ 1），流動(dòng)相B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～10 min，30.0%流動(dòng)相A；10～20 min，30.0%→38.0%流動(dòng)相A；20～40 min，38.0% → 60.0% 流 動(dòng) 相 A；40～ 44 min，60.0%→30.0%流動(dòng)相A）[3-5]，流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)試驗(yàn)，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的保留時(shí)間為0～20 min，檢測波長為254 nm[6-10]；茅術(shù)醇和β-桉葉醇的保留時(shí)間為20～34 min，檢測波長為203 nm[11-12]；蒼術(shù)素的保留時(shí)間為34～44 min，檢測波長為340 nm[5]。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備分別精密稱定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素對照品適量，加入甲醇溶解并稀釋，依次制成質(zhì)量濃度為0.430、0.585、1.642、1.516和1.278 g·L-1的對照品儲(chǔ)備液；然后，依次量取各對照品儲(chǔ)備液1.5、1.0、5.0、7.5和5.0 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，其中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的質(zhì)量濃度依次為0.0129、0.0117、0.1642、0.2274和0.1278 g·L-1。

2.2.2 供試品溶液的制備取保安萬靈丹樣品適量，剪碎，取5.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇[6,8-9,13]，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（200 W，20 kHz）1 h，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品對照溶液的制備按照保安萬靈丹處方工藝分別制備不含防風(fēng)的防風(fēng)陰性樣品和不含蒼術(shù)的蒼術(shù)陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制得防風(fēng)陰性樣品對照溶液和蒼術(shù)陰性樣品對照溶液。

2.3 色譜系統(tǒng)專屬性考察

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，將混合對照品溶液、供試品溶液、防風(fēng)陰性樣品對照溶液和蒼術(shù)陰性樣品對照溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素等各

組分間及與樣品中其他成分或雜質(zhì)間的分離效果良好，即其他成分或雜質(zhì)對各目標(biāo)組分的測定無干擾；理論塔板數(shù)按5-O-甲基維斯阿米醇苷計(jì)算不低于2 500，各組分間分離度均大于1.5（色譜圖見圖1）。

圖1 色譜系統(tǒng)專屬性實(shí)驗(yàn)色譜圖Figure 1 Chromatograms from specificity test of the chromatographic system

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下制備的每個(gè)對照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分別置于5個(gè)10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表1。

表1 各對照品的回歸方程和線性范圍Table1 Regression equations and linear ranges of various reference substances

由表1可見，各對照品的質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按“2.1”

項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果測得，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的峰面積RSD分別為1.39%、1.57%、0.54%、0.44%和0.85%（n=6），表明方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批號(hào)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測得，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的峰面積RSD分別為1.52%、1.32%、0.72%、0.35%和0.59%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備一供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果測得，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的峰面積RSD分別為1.07%、1.26%、0.77%、0.54%和0.89%（n=6），證明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

稱取已知各組分含量的保安萬靈丹（升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的含量分別為0.136、0.109、1.653、2.281和1.268 mg·g-1）適量，剪碎，取2.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液25 mL，甲醇稀釋至刻度，稱定質(zhì)量，超聲處理（200 W，20 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，作為加樣供試品試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。重復(fù)以上操作6次。結(jié)果測得，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素的平均加樣回收率/RSD(n=6)分別為97.49%/1.45%、96.81%/0.94%、98.60%/1.65%、97.96%/1.38%和99.22%/1.24%。

2.9 樣品測定

取3個(gè)批號(hào)的樣品各3份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，記錄色譜圖。各批號(hào)樣品的含量測定結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果Table2 Results of content determination for samples

3 討論

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者分別選用50%甲醇、75%甲醇和色譜純甲醇對樣品進(jìn)行超聲（200 W，20 kHz）提取1 h，并對提取效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，色譜純甲醇超聲提取效果最佳，所提取各目標(biāo)組分的含量均高于50%甲醇和75%甲醇提取組。且分別用色譜純甲醇對樣品進(jìn)行超聲（200 W，20 kHz）提取0.5、1 和1.5 h，以考察超聲提取時(shí)間對提取效率的影響，結(jié)果表明，超聲提取1 h的效果與超聲提取1.5 h的差異不大，但明顯高于超聲提取0.5 h。故最終本文選用色譜純甲醇對樣品進(jìn)行超聲（200 W，20 kHz）提取1 h，制備供試品溶液。

本文所建立同時(shí)測定保安萬靈丹中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、茅術(shù)醇、β-桉葉醇和蒼術(shù)素含量的多波長HPLC梯度洗脫法，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用作保安萬靈丹的質(zhì)量控制方法。

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Simultaneous Determination of Prim-O-glucosylcimifugin, 5-O-methylvisammioside, Hinesol,β-eudesmol and Atractylodin in Bao'an Wanling Dan by Multiwavelength HPLC Gradient Elution Method

YANG Xuemei1, BAN Xiaojun2, YANG Haihong1, FAN Xiaoyu3
(1.Gansu Jinchang Drug Inspection Testing Center, Jinchang 737100, China; 2.Gansu Zhangye Food and Drug Inspection Testing Center, Zhangye 734000, China; 3.School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110013, China)

Objective： To establish a method for simultaneous determination of prim-O-glucosylcimifugin, 5-O-methylvisammioside, hinesol,β-eudesmol and atractylodin in Bao'an Wanling Dan.Methods：A multiwavelength HPLC gradient elution method was adopted with the chromatographic conditions including a C18column(200 mm×4.6 mm, 5 μm), methanol-acetonitrile(2：1) as mobile phase A, 0.1% phosphoric acid solution as mobile phase B, a fow rate of 1.0 mL · min-1, an injection volume of 20 μL and the detection wavelengths of 254 nm(for prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methylvisammioside), 203 nm(for hinesol andβ-eudesmol) and 340 nm(for atractylodin).Results： The linear ranges of prim-O-glucosylcimifugin, 5-O-methylvisammioside, hinesol,β-eudesmol and atractylodin were 4.30-86.00 mg · L-1(r=0.999 4), 5.85-117.00 mg · L-1(r=0.999 7), 16.42-328.40 mg · L-1(r=0.999 3), 15.16-303.20 mg · L-1(r=0.999 9) and 12.78-255.60 mg · L-1(r=0.999 5) respectively.The RSDs of the peak areas of each target component detected in precision, reproducibility and stability tests were less than 2.0%.The average recoveries/ RSDs(n=6) of prim-O-glucosylcimifugin, 5-O-methylvisammioside, hinesol,β-eudesmol and atractylodin were 97.49%/1.45%, 96.81%/0.94%,

Bao'an Wanling Dan; prim-O-glucosylcimifugin; 5-O-methylvisammioside; hinesol;β-eudesmol; atractylodin; content determination

R286.0

A

1001-5094（2015）05-0384-05

接受日期：2015-04-03

*通訊作者：班小軍，主管藥師；研究方向：藥品檢驗(yàn)及天然藥物有效成分研究；Tel：0936-8312120； E-mail：496108658@qq.com

98.60%/1.65%, 97.96%/1.38% and 99.22%/1.24% respectively.Conclusion：The method is simple, accurate and reproducible, thus it could be used as the approach for the quality control of Bao'an Wanling Dan.