合成生物學(xué)技術(shù)在糖胺聚糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

唐東洋，虞菊萍，陳榮，高向東

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009）

合成生物學(xué)技術(shù)在糖胺聚糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

唐東洋，虞菊萍，陳榮，高向東*

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210009）

糖胺聚糖是一類直鏈酸性多糖，具有優(yōu)良的生物相容性和生理活性，被廣泛應(yīng)用于臨床治療，并用作藥物運輸載體，其中透明質(zhì)酸、肝素和硫酸軟骨素的相關(guān)研究最為深入。由于傳統(tǒng)方式（如動物組織提取法等）制備糖胺聚糖，存在外毒素、病毒等致病因子污染的風(fēng)險，因而，利用合成生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建重組工程菌株生產(chǎn)糖胺聚糖，逐漸受到研究者們的重視。主要圍繞透明質(zhì)酸、肝素前體及軟骨素，綜述糖胺聚糖的生物合成途徑，并探討產(chǎn)糖胺聚糖基因工程菌的構(gòu)建以及糖胺聚糖生物合成過程中分子質(zhì)量調(diào)控機制，以期為構(gòu)建產(chǎn)高品質(zhì)糖胺聚糖工程菌株提供新思路。

合成生物學(xué)；透明質(zhì)酸；肝素前體；軟骨素；基因工程菌

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）也被稱為黏多糖，是一類帶負電荷的直鏈酸性多糖，大多是由糖醛酸和氨基己糖組成的二糖單元反復(fù)交聯(lián)而形成[1]。GAG廣泛存在于自然界中，是動物結(jié)締組織間質(zhì)和細胞間質(zhì)的特有成分，也是某些病原微生物的細胞莢膜多糖成分。按照單糖組成及連接方式的差異，GAG可分為透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）、肝素（heparin, Hep）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate, CS）、硫酸皮膚素（dermatan sulfate, DS）和硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate, KS）（見表1）。

表1 常見GAG及其組成骨架結(jié)構(gòu)Table1 Common GAGs and their backbone structures

GAG具有特殊的生理活性，其中HA、Hep及CS的相關(guān)研究最為深入[2]。目前，HA主要通過鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生[3]，而Hep和CS主要通過動物組織提取法獲得[4]，但傳統(tǒng)方法制得的GAG會給臨床使用帶來一定的安全風(fēng)險。2008年的Hep污染事件就給人們敲響了警鐘[5]，

美國FDA因此制定了更嚴格的GAG生產(chǎn)及質(zhì)量檢測標準，也迫使研究者們尋找安全性更高的GAG生產(chǎn)方式。

已知的化學(xué)酶法合成策略已能實現(xiàn)對GAG的體外合成，這一度被認為是GAG傳統(tǒng)制備方式的替代手段。然而，受制于單糖前體的高昂價格，該法目前只能用于小批量GAG寡糖的合成，尚暫時無法在工業(yè)上進行大規(guī)模應(yīng)用[6]。早期的研究已證實，大腸埃希菌K4及F型禽多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖含有軟骨素[7-8]，大腸埃希菌K5及A、D、F型禽多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖含有Hep前體Heparosan[4]，并且軟骨素及Heparosan經(jīng)過化學(xué)修飾，即可成為CS及Hep。得益于合成生物學(xué)的發(fā)展及GAG生物合成途徑的揭示，使用工業(yè)安全微生物作為宿主構(gòu)建重組工程菌進行GAG生產(chǎn)成為了可能。而且，利用合成生物學(xué)技術(shù)制備的GAG可避免病毒等致病因子的污染，由此可顯著提高產(chǎn)品使用的安全性；這種技術(shù)方法還具有易于進行放大生產(chǎn)的優(yōu)點，因而逐漸成為GAG傳統(tǒng)生產(chǎn)方法的更為現(xiàn)實可行的替代手段。本文主要圍繞HA、Heparosan及軟骨素，綜述GAG的生物合成途徑，并探討產(chǎn)GAG基因工程菌的構(gòu)建以及GAG生物合成過程中分子質(zhì)量調(diào)控機制，以期為構(gòu)建產(chǎn)高品質(zhì)GAG工程菌株提供新思路。

1 糖胺聚糖的生物合成途徑

GAG作為多種病原菌的細胞莢膜多糖成分，其生物合成過程可分為3個步驟：①前體單糖分子的產(chǎn)生；②GAG鏈的聚合延伸；③新生GAG長鏈轉(zhuǎn)移至細胞膜外[1]。目前，已有多種不同生物來源的GAG及其合成酶被成功鑒定（見表2）。

表2 天然微生物來源的常見GAG及其合成酶Table2 Common GAGs and their synthetase from natural microbial sources

1.1 透明質(zhì)酸的生物合成

HA是由GlcNAc和GlcUA通過β-1,4和β-1,3糖苷鍵而組成的酸性黏多糖，其中兩種單糖均來源于葡萄糖代謝通路，HA的生物合成過程包括10步反應(yīng)（見圖1-1）。HA合成酶（HAS）是促使二磷酸尿苷（UDP）-GlcUA 與UDP-GlcNAc進行聚合反應(yīng)的執(zhí)行者，目前已發(fā)現(xiàn)兩類HAS，其中Ⅰ型HAS共有3種來源，即來源于細菌的HAS（sphasA、sehasA等）、來源于病毒的HAS（cvHAS）及來源于脊椎動物的HAS（xlHAS1、mmHAS等），但是僅有1種Ⅱ型HAS被發(fā)現(xiàn)，即來源于A型禽多殺性巴氏桿菌的HAS（PmHAS）。這兩類HAS的區(qū)別在于酶的大小、拓撲結(jié)構(gòu)、合成方向及催化合成方式的不同[9]。

1.2 肝素前體的生物合成

Heparosan是由GlcNAc 與GlcUA通過α-1,3和β-1,4糖苷鍵連接而形成[10]，與HA生物合成過程的唯一差別在于糖鏈聚合及延伸的執(zhí)行者不同（見圖1-1）。Heparosan是大腸埃希菌K5及A、D、F型禽多殺性巴氏桿菌的莢膜多糖成分，目前發(fā)現(xiàn)有兩種不同類型微生物來源的Heparosan合成酶。在大腸埃希菌K5中，需要GlcUA轉(zhuǎn)移酶KfiC及GlcNAc轉(zhuǎn)移酶KfiA共同作

用，以完成Heparosan糖鏈組裝，而在禽多殺性巴氏桿菌中，只需單一Heparosan合成酶，即可完成糖鏈組裝過程，此酶包括來源于D型禽多殺性巴氏桿菌的PmHS1或存在于A、D、F型禽多殺性巴氏桿菌中的PmHS2[7]。雖然PmHS1與 PmHS2具有很高的序列同源性（約65%），但卻表現(xiàn)出完全不同的金屬離子偏愛性、底物單糖分子親和力及催化合成能力[4]。也有研究認為，PmHS1主要負責(zé)大分子質(zhì)量Heparosan的合成，而PmHS2負責(zé)小分子質(zhì)量Heparosan的合成[11]。

1.3 軟骨素的生物合成

組成軟骨素的兩種單糖為GlcUA和GalNAc。因此，不同于HA或Heparosan的生物合成過程，軟骨素合成需要經(jīng)歷UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)換至UDP-GalNAc的過程，隨后軟骨素合成酶催化糖鏈的聚合反應(yīng)[12]（見圖1-2）。目前發(fā)現(xiàn)有兩種微生物來源的軟骨素合成酶，分別為來源于大腸埃希菌K4的KfoC及來源于F型禽多殺性巴氏桿菌的PmCS[4]。KfoC與PmCS具有約60%的同源性，因而推斷這兩種酶催化多糖合成的方式相似[7]。

圖1 GAG生物合成途徑示意圖Figure 1 Schematic diagram of biosynthetic pathways for GAGs

2 產(chǎn)糖胺聚糖基因工程菌的構(gòu)建

目前，臨床使用的GAG主要來源于動物組織，而為擴展GAG的來源，并提高GAG臨床使用的安全性，工業(yè)安全微生物被選作表達宿主，用于構(gòu)建產(chǎn)GAG重組菌株，以期創(chuàng)造出一種安全性高及生產(chǎn)成本更具優(yōu)勢的GAG生產(chǎn)方式。

2.1 產(chǎn)透明質(zhì)酸工程菌

由于微生物來源的HA與生物體內(nèi)的HA結(jié)構(gòu)一致，因此HA成為研究者們最早利用合成生物學(xué)技術(shù)進行生產(chǎn)嘗試的GAG。目前，已有多種微生物經(jīng)成功改造而具備HA生產(chǎn)能力，如大腸埃希菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、畢赤酵母（Pichia pastoris）、土壤農(nóng)桿菌（Agrobacterium sp.）及乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等。值得注意的是，產(chǎn)HA基因工程菌的構(gòu)建策略和培養(yǎng)方式的不同造成了HA產(chǎn)量及分子質(zhì)量的巨大差異。

2.1.1 大腸埃希菌工程菌Yu等[13]以大腸埃希菌Top10作為宿主，將Ⅰ型HAS基因sphasA和sehasA與HA前體合成關(guān)鍵基因分別組合構(gòu)建表達載體，由此構(gòu)建的spABC（sphasA/ugd/galF）菌株其HA產(chǎn)量可達48 mg·L-1，而sseAB（sehasA/ugd）菌株的HA產(chǎn)量可達200 mg·L-1，明顯高于spABC菌株產(chǎn)量，表明sehasA

具備更強的HA合成能力。而且，分子質(zhì)量測定結(jié)果顯示，sseAB菌株在不同生長條件下可獲得相對分子質(zhì)量為3.5×105～1.9×106的HA，表明菌株培養(yǎng)環(huán)境條件的改變會對所產(chǎn)HA的分子質(zhì)量造成較大影響。Mao等[14]嘗試將Ⅱ型HAS基因PmHAS和來自大腸埃希菌K5的尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶基因KfiD共轉(zhuǎn)入大腸埃希菌JM109，并采用補料分批發(fā)酵方式，致使此基因工程菌可產(chǎn)2.0～3.8 g·L-1的HA，且增加前體單糖的供應(yīng)，可有效提高HA產(chǎn)量。Ⅰ和Ⅱ型HAS在大腸埃希菌中的成功表達及高品質(zhì)HA的獲得，表明大腸埃希菌可作為一種潛在宿主通過基因改造而成為能滿足HA工業(yè)化生產(chǎn)需求的工程菌株，并因此有望產(chǎn)出具特定分子質(zhì)量的HA。

2.1.2 枯草芽孢桿菌工程菌Widner等[15]將sehasA與HA前體合成相關(guān)酶基因構(gòu)建表達載體，在枯草芽孢桿菌A164Δ5菌株中重構(gòu)HA代謝通路，這是研究者們首次在異源宿主中實現(xiàn)HA的表達，并且證明UDPGlcUA合成途徑的關(guān)鍵酶基因tuaD的過表達有利于HA的積累。該研究小組所篩選出的RB184 (sehasA/tuaD)菌株其HA產(chǎn)量為0.8～1.0 g·L-1，所產(chǎn)HA相對分子質(zhì)量可達1.1×106～1.2×106，該菌株已被Novozymes公司成功用于工業(yè)生產(chǎn)。然而，在生產(chǎn)過程中，HA的積累會造成發(fā)酵液黏度急劇增加，故而氧傳遞效率成為制約HA產(chǎn)量提升的關(guān)鍵。Chien等[16]嘗試在過表達sehasA及tuaD的工程菌株中引入透明顫菌血紅蛋白（vitreoscilla hemoglobin，vhb），該蛋白可在氧濃度極低的條件下從細胞外攝取氧，從而維持細胞正常生理過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，vhb過表達的菌株細胞密度相較不含vhb的菌株增加了25%，HA的產(chǎn)量提升了2倍，達到1.8 g·L-1。

為了探究HA分子質(zhì)量的調(diào)節(jié)機制，以獲得均一分子質(zhì)量HA，Jia等[17]將HAS基因PmHAS與HA前體合成關(guān)鍵酶基因分別構(gòu)建于不同表達載體，創(chuàng)新性地通過兩步誘導(dǎo)策略調(diào)控基因表達，成功實現(xiàn)了對HA分子質(zhì)量調(diào)控。由此制備的工程菌株TPG223（PmHAS/ tuaD/gtaB）其HA產(chǎn)量可達6.8 g·L-1，并且通過誘導(dǎo)策略的改變，可獲得相對分子質(zhì)量分別為8×103和5.4×106且分子質(zhì)量均一的HA，為工業(yè)化生產(chǎn)均一分子質(zhì)量HA，提供了全新的思路。從目前的研究成果來看，在眾多經(jīng)改造而用于HA生產(chǎn)的微生物宿主中，枯草芽孢桿菌可被譽為構(gòu)建工程菌株的最佳宿主。

2.1.3 畢赤酵母工程菌Jeong等[18]克隆了來自非洲爪蟾（Xenopus laevis）的HAS基因xhasA2和xhasB以及來自畢赤酵母的HAS基因hasC、hasD及hasE，并將這些基因以不同的組合方式構(gòu)建組成型或誘導(dǎo)型表達載體。由此制備的畢赤酵母工程菌株其HA產(chǎn)量可達0.8～1.7 g·L-1，所產(chǎn)HA的相對分子質(zhì)量在1.2×106左右。另外，該研究團隊還發(fā)現(xiàn)，降低菌株培養(yǎng)溫度或HAS表達水平，可使得所產(chǎn)HA的相對分子質(zhì)量從1.2×106增至2.5×106或2.1×106。這一研究首次將來源于真核生物的HAS用于HA生產(chǎn)，而重組畢赤酵母表達系統(tǒng)的成功構(gòu)建，也為HA生產(chǎn)方式提供了新的選擇。

2.1.4 土壤農(nóng)桿菌工程菌Mao等[19]在土壤農(nóng)桿菌ATCC 31749菌株中成功表達了PmHAS以及來自大腸埃希菌K5的UDP-葡萄糖脫氫酶基因，由此構(gòu)建的重組菌其HA產(chǎn)量可達0.3 g·L-1，所產(chǎn)HA的相對分子質(zhì)量在7×105～2×106之間。這是土壤農(nóng)桿菌首次被用于產(chǎn)HA工程菌株的構(gòu)建。盡管從結(jié)果來看，土壤農(nóng)桿菌工程菌株的HA產(chǎn)量還有待提高，但由于其為公認的食品級安全微生物宿主，故而可以進一步研究提高其HA產(chǎn)量的策略，為工業(yè)化應(yīng)用打下堅實的基礎(chǔ)。

2.1.5 乳酸乳球菌工程菌Prasad等[20]將sehasA與hasB、hasC組合后引入乳酸乳球菌NZ9000菌株，結(jié)果，所構(gòu)建的pSJR2菌株（sehasA/hasB）其HA產(chǎn)量為107 mg·L-1，pSJR3菌 株（sehasA/hasB/hasC） 的HA產(chǎn)量為234 mg·L-1，表明UDP-GlcUA水平的高低是影響HA產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。與枯草芽孢桿菌只需過表達hasB即可保證HA高表達[15]不同，在乳酸乳球菌中需同時過表達hasB及hasC才能實現(xiàn)HA產(chǎn)量最大化。在此基礎(chǔ)上，Prasad等[21]又構(gòu)建了pSJR6菌株（sehasA/ hasB/hasD），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與pSJR2及pSJR3菌株相比，pSJR6菌株具有最高的HA產(chǎn)率，表明，共表達UDPGlcUA與UDP-GlcNAc通路關(guān)鍵酶基因，使前體單糖達到適當(dāng)比例，能給HA的生產(chǎn)帶來最大益處。鑒于HA的分子質(zhì)量會極大地影響其應(yīng)用范圍，研究者將HA表達相關(guān)基因整合入乳酸乳球菌基因組，結(jié)果，相較于質(zhì)粒表達系統(tǒng)，由此產(chǎn)生的HA相對分子質(zhì)量由2×106增至3.5×106～4×106[22]，這為高分子質(zhì)量HA的獲取提供了新來源。Sheng等[23]采用lacF基因作為篩選標志，過表達hasA、hasB及hasC的菌株其HA產(chǎn)量可達（0.594±0.029）g·L-1。提示，盡管這類菌株其HA產(chǎn)

量還有待提高，但是非抗性篩選標志將有助于其在工業(yè)上的應(yīng)用。

2.2 產(chǎn)肝素前體工程菌

Heparosan經(jīng)修飾可成為Hep，因此通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)Heparosan并加之特定化學(xué)修飾的策略，可視為傳統(tǒng)Hep生產(chǎn)方法的一種替代手段。目前研究者們只是在大腸埃希菌作為宿主的表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了Heparosan的合成，其中Barreteau等[24]成功將來源于大腸埃希菌K5的Heparosan合成酶基因KfiA、KfiB、KfiC及KfiD轉(zhuǎn)入大腸埃希菌K12中，由于大腸埃希菌K12缺少Heparosan轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，因此該合成系統(tǒng)所生產(chǎn)的Heparosan主要集中在細胞內(nèi)，補料分批發(fā)酵條件下的產(chǎn)量可達1 g·L-1；此外，通過在該系統(tǒng)中共表達K5裂解酶，可獲得聚合度2-10（DP2-10）的Heparosan寡糖分子且產(chǎn)量接近1 g·L-1。雖然通過該系統(tǒng)可獲得低分子質(zhì)量Heparosan及其寡糖，但其胞內(nèi)表達會給下游分離純化帶來很大困難。因此， Zhang等[25]嘗試在大腸埃希菌BL21 StarTM(DE3)中構(gòu)建Heparosan合成通路，結(jié)果，在恒定溶氧補料分批發(fā)酵方式下，由此制備的sABCD(KfiA/KfiB/KfiC/KfiD)菌株實現(xiàn)了Heparosan的胞外分泌，其產(chǎn)量可達1.88 g·L-1。該項研究為Heparosan的工業(yè)化生產(chǎn)提供了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，并且為采用其他類型宿主構(gòu)建Heparosan高產(chǎn)工程菌株提供了依據(jù)。隨著生物合成系統(tǒng)中Heparosan產(chǎn)量的不斷提升以及Heparosan修飾工藝的引入，可實現(xiàn)為臨床提供非動物組織來源的Hep，也必將極大地提高Hep的品質(zhì)及其臨床使用安全性。

2.3 產(chǎn)軟骨素工程菌

得益于HA和Heparosan生物合成系統(tǒng)的成功建立，研究者們又開展了對另一種重要GAG——軟骨素的生物合成系統(tǒng)研究，以期采用合成生物學(xué)技術(shù)創(chuàng)造出一種全新的軟骨素生產(chǎn)方式。

2.3.1 枯草芽孢桿菌工程菌20世紀90年代，DeAngelis（Biochemistry, 1996年）便報道了一種在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)PmCS表達的方法，并在專利中提供了重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)軟骨素的方法。雖然該專利中未見提及軟骨素的具體產(chǎn)量，但是該研究成果為后續(xù)利用工業(yè)安全微生物構(gòu)建軟骨素生產(chǎn)菌株提供了很好的思路。

2.3.2 大腸埃希菌工程菌He等[12]首次在大腸埃希菌BL21 StarTM(DE3)中實現(xiàn)了軟骨素的合成，該研究團隊將軟骨素合成酶基因KfoA、KfoC及KfoF以不同的順序組合到仿操縱子體系中后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)KfoF、KfoA和KfoC表達分別處于高、中、低水平時，采用補料分批發(fā)酵此工程菌株所獲軟骨素的產(chǎn)量達2.4 g·L-1，接近大腸埃希菌K4的生產(chǎn)水平。這給予研究者們極大的鼓舞，相信隨著軟骨素轉(zhuǎn)運機制的揭示及對工程菌株發(fā)酵過程的優(yōu)化，軟骨素生物合成產(chǎn)量有望得到進一步提高。這項研究成果不僅擴大了CS的來源，而且有助于降低CS生產(chǎn)成本。此外，可在工程菌株中共表達硫酸化酶，從而能同步將軟骨素修飾成為具有活性的CS。

3 糖胺聚糖生物合成過程中分子質(zhì)量調(diào)控機制

多糖聚合度的差異會導(dǎo)致分子質(zhì)量不同，進而影響其活性，GAG家族尤為如此。研究表明，高分子質(zhì)量HA具有抗炎活性，而低分子質(zhì)量HA卻能促進炎癥發(fā)生[26]。此外，可用作藥物運輸載體的GAG分子大多集中于小分子質(zhì)量范圍，如低分子質(zhì)量的HA[27]及肝素或Heparosan寡糖[28]?？梢?，臨床需要生產(chǎn)特定分子質(zhì)量的GAG，以提高其藥效及安全性，因此有必要探討GAG生物合成過程中其分子質(zhì)量的調(diào)控機制。目前，研究者對HA生物合成過程中其分子質(zhì)量的影響因素有了較為深入的認識，而對于Heparosan或軟骨素的分子質(zhì)量調(diào)控機制尚未見報道。因此，這里主要探討HA生物合成過程中其分子質(zhì)量的調(diào)控機制，期望為其他GAG生物合成過程中分子質(zhì)量調(diào)控機制的研究提供借鑒。

3.1 菌株培養(yǎng)條件

HA在生物合成過程中需要與產(chǎn)HA菌株生長相互競爭底物及高能分子，因此其合成必定會受到菌株培養(yǎng)條件的影響。Armstrong等（Appl Environ Microbiol, 1997年）考察了鏈球菌發(fā)酵過程中pH、初始葡萄糖濃度和培養(yǎng)溫度對所產(chǎn)HA分子質(zhì)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液在pH 6.3～8.0范圍內(nèi)時，pH的變化不會影響所產(chǎn)HA的分子質(zhì)量，而葡萄糖濃度的增加或培養(yǎng)溫度的降低則有利于高分子質(zhì)量的HA產(chǎn)生。培養(yǎng)溫度降低致使所產(chǎn)HA分子質(zhì)量增加的效應(yīng)源于菌株生長速率下降而導(dǎo)致更多的前體糖被用于HA合成，該結(jié)論在重組工程菌中同樣成立[18]。

Sun等[29]研究證實，在產(chǎn)HA菌株發(fā)酵液中加入磷脂酰膽堿，可使所產(chǎn)HA的分子質(zhì)量提高67.1%。這是因為，磷脂酰膽堿能增加HA合成通路的代謝流量，

并且能提高細胞膜流動性，使得HA長鏈能輕易通過細胞膜。Pires等[30]在研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)HA菌株發(fā)酵液中Na+的加入有利于獲得高分子質(zhì)量HA，表明HA分子質(zhì)量受菌株發(fā)酵液中金屬離子種類的影響。另外，產(chǎn)HA菌株發(fā)酵液的攪拌速率也會對所產(chǎn)HA分子質(zhì)量造成很大影響：在低攪拌速率范圍內(nèi)，提高攪拌速率，可增加發(fā)酵液溶氧水平，從而提高HA分子質(zhì)量；但繼續(xù)增大攪拌速率，則會造成HA分子質(zhì)量降低。這主要是由于過大的剪切力造成HA鏈提前脫落，并且攪拌速率過高會增加發(fā)酵液中活性氧水平，進而降低HA分子質(zhì)量[31]。

產(chǎn)HA菌株培養(yǎng)時間的長短對HA分子質(zhì)量的影響同樣令人關(guān)注。Armstrong等（Appl Environ Microbiol, 1997年）研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌所產(chǎn)HA分子質(zhì)量與其培養(yǎng)時間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。Yu等[13]在對重組大腸埃希菌菌株的研究中也得出類似結(jié)論。但畢赤酵母所產(chǎn)HA分子質(zhì)量并不受其培養(yǎng)時間的影響[18]。另外，Jia等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)，基于枯草芽孢桿菌構(gòu)建的TPG223菌株所產(chǎn)HA分子質(zhì)量與其培養(yǎng)時間卻呈現(xiàn)出一定的負相關(guān)性，因而需進一步考察并明確菌株培養(yǎng)時間對所產(chǎn)HA分子質(zhì)量的影響。

基于以上的研究成果，Lai等[32]采用氧運輸載體及最優(yōu)的攪拌速率，在獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）中獲得相對分子質(zhì)量高達1.54×107的HA。表明，產(chǎn)HA菌株在合適的培養(yǎng)條件下，可產(chǎn)出高分子質(zhì)量的HA。

3.2 菌株中UDP-GlcUA與UDP-GlcNAc的比例

Marcellin研究小組發(fā)現(xiàn)，含有質(zhì)粒的工程菌相對于野生菌株，能產(chǎn)生更大分子質(zhì)量的HA，這是由于質(zhì)粒的引入能促進UDP-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸酶（glmU）的表達，并降低UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮轉(zhuǎn)移酶（murA）的表達，進而提高菌株中UDP-GlcNAc的水平，表明菌株所產(chǎn)HA分子質(zhì)量與菌株中UDP-GlcNAc濃度密切相關(guān)[33-34]。Chen等[35]就菌株中UDP-GlcNAc對所產(chǎn)HA分子質(zhì)量的影響程度進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中加入葡萄糖胺，可顯著提高菌株中UDPGlcNAc濃度，但產(chǎn)生的HA其分子質(zhì)量較小，這是由于UDP-GlcNAc濃度升高，加劇了兩種前體之間的比例不協(xié)調(diào)。利用基因工程手段，致使產(chǎn)HA菌株過表達UDP-GlcNAc通路相關(guān)基因后，同樣也可得到類似結(jié)論。這些研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)提高菌株中UDPGlcNAc的濃度，能夠提高HA的分子質(zhì)量，但UDPGlcNAc濃度升至一定限度時，這種效應(yīng)便不再存在。Sheng等[36]的研究也證實，產(chǎn)HA菌株中HAS與UDP-葡萄糖脫氫酶的mRNA比例發(fā)生變化，會影響UDPGlcUA與UDP-GlcNAc的比例，進而對所產(chǎn)HA分子質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響。基于此，有研究者成功設(shè)計出可產(chǎn)高分子質(zhì)量HA的重組工程菌株[37]。

3.3 透明質(zhì)酸合成酶的特性

在HA生物合成過程中，HAS可獨立完成HA雙糖分子的組裝。由于HAS有諸多來源，而不同來源的HAS各有其特性，因此采用不同來源的HAS或?qū)AS進行特定的改造，就有可能生產(chǎn)出不同分子質(zhì)量的HA。

Pummill等[38]對源于哺乳動物的HAS——xlHAS1進行突變研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該酶發(fā)生S77F、S77I、C117S和C239S的突變后，由其催化合成的HA分子質(zhì)量增加，而發(fā)生S77A、S77D、S77V、S77Y/R271G或Y107F的突變后，則并不影響其催化合成的HA分子質(zhì)量，但發(fā)生S77T和C337S的突變后，卻會引起其催化合成的HA分子質(zhì)量降低。Kumari等[39]將sehasA中兩個保守的極性氨基酸進行突變，即使48位的賴氨酸發(fā)生K48R和K48E突變以及327位的谷氨酸發(fā)生E327Q、E327K和E327D突變，然后分別構(gòu)建了含有單突變及雙突變（E327K/ K48E）的sehasA，并對其催化產(chǎn)物的分子質(zhì)量進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變之后的sehasA酶活力相較于野生型酶均有一定程度的下降，由此造成催化產(chǎn)物分子質(zhì)量的降低。對來源于鼴鼠的HAS分析發(fā)現(xiàn)，雖然該酶中有兩個天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，但它卻能催化生產(chǎn)出分子質(zhì)量高達1.2×107的HA[26]。目前的研究表明，HAS分子與其催化產(chǎn)物分子之間的相互作用強度會影響HA鏈的結(jié)合及延伸，進而影響HA的分子質(zhì)量。提示，可以通過一定手段對HAS進行定向改造，從而收獲特定分子質(zhì)量的HA。

4 結(jié)語

隨著人們健康意識的提升以及臨床對于高品質(zhì)GAG的需求增加，傳統(tǒng)生產(chǎn)方式（如動物組織提取法等）所制得的GAG已不能滿足現(xiàn)今的需要，這一現(xiàn)狀促使

研究者們不斷開發(fā)新的GAG生產(chǎn)方式。目前，利用合成生物學(xué)技術(shù)及理念構(gòu)建微生物細胞工廠，進行大宗化學(xué)品、天然產(chǎn)物等的生產(chǎn)，已成為研究熱點，其中很多產(chǎn)品已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，且創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟價值。受此啟發(fā)，利用重組工程菌株生產(chǎn)GAG的研究也在積極展開，研究者們開發(fā)設(shè)計了一系列重組生物生產(chǎn)系統(tǒng)用于GAG的生產(chǎn)，并嘗試對其產(chǎn)量及分子質(zhì)量進行調(diào)控，且已取得豐碩成果。當(dāng)然，還有一些亟待解決的問題，如生物合成的Heparosan及軟骨素需經(jīng)后續(xù)修飾才能成為活性形式，不過可嘗試利用合成生物學(xué)技術(shù)，將參與修飾反應(yīng)的酶引入GAG合成系統(tǒng)，以解決此問題，進而收獲活性形式的GAG。此外，GAG產(chǎn)量及分子質(zhì)量的調(diào)控機制仍未被完全揭示，這也可通過合成生物學(xué)加之相關(guān)學(xué)科如系統(tǒng)生物學(xué)等的發(fā)展，予以進一步探究?？梢韵嘈牛诓痪玫膶?，利用重組工程菌株生產(chǎn)GAG的方式必將取代傳統(tǒng)的動物組織提取法，這將極大地提高GAG的使用安全性，并降低其生產(chǎn)成本，最終為患者帶來福音。

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Application of Synthetic Biology Technologies in Glycosaminoglycan Production

TANG Dongyang, YU Juping, CHEN Rong, GAO Xiangdong

(School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)

Glycosaminoglycans(GAGs), one class of unbranched acidic polysaccharides with superior biocompatibility and physiological activity, have been widely used in clinic and as the carriers for drug delivery, among which hyaluronic acid, heparin and chondroitin sulfate have been most intensively studied.Allowing for the risk of the pollution of pathogenic factors such as exotoxin, virus and so on being brought in by conventional means for GAG production such as extraction from animal tissue, the construction of recombinant engineered strains for GAG production by utilizing synthetic biology technologies has been arousing great interest among scientists.Taking hyaluronic acid, heparosan and chondroitin as examples, this review focused on the biosynthetic pathways for GAGs, the constructions of genetically engineered strains producing GAGs and the mechanisms controlling molecular weight in biosynthesis of GAGs, with a view to providing new insights for the construction of genetically engineered strains producing high-quantity GAGs.

synthetic biology; hyaluronic acid; heparosan; chondroitin; genetically engineered strain

Q538; Q782

A

1001-5094（2015）05-0376-08

接受日期：2015-04-10

項目資助：國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項資助項目（No.2012ZX09502001-004）；江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊資助項目

*通訊作者：高向東，教授；

研究方向：生物大分子結(jié)構(gòu)與功能；

Tel：025-83271298； E-mail：xdgao@cpu.edu.cn