吳興武(綜述)，林　戈，胡　亮※(審較)

(1.中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410000； 2.人類干細(xì)胞國(guó)家工程研究中心，長(zhǎng)沙 410000)

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分子生物醫(yī)學(xué)

染色質(zhì)修飾因子在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞重編程中的研究進(jìn)展

吳興武1△(綜述)，林戈1,2，胡亮1,2※(審較)

(1.中南大學(xué)生殖與干細(xì)胞工程研究所，長(zhǎng)沙 410000； 2.人類干細(xì)胞國(guó)家工程研究中心，長(zhǎng)沙 410000)

摘要：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來(lái)，一系列的研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)修飾因子對(duì)于干性的維持和促進(jìn)重編程進(jìn)程不可或缺。在重編程過(guò)程中抑制一些染色質(zhì)修飾酶能提高重編程效率，而敲減或敲除一些染色質(zhì)修飾因子則使重編程效率下降或不能實(shí)現(xiàn)重編程。該文就近幾年發(fā)現(xiàn)的在iPSCs重編程過(guò)程中發(fā)揮重要作用的染色質(zhì)修飾因子及其作用機(jī)制予以綜述。

關(guān)鍵詞：重編程；染色質(zhì)修飾因子；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

通過(guò)體細(xì)胞重編程獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)因其自我更新、多譜系分化能力和免疫排異反應(yīng)等方面的優(yōu)勢(shì)而在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受青睞[1]。iPSCs重編程是一個(gè)緩慢、漸進(jìn)且低效的過(guò)程，涉及染色質(zhì)的廣泛重新組織，包括DNA的甲基化、組蛋白的修飾和核小體的重塑等過(guò)程[2]。染色質(zhì)修飾因子主要指DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白修飾(主要包括組蛋白甲基化、乙?；?、磷酸化等)酶及ATP酶依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合體(chromatin-remodeling complexes，CRCs)三類。在重編程中，它們和轉(zhuǎn)錄因子共同參與染色質(zhì)的重構(gòu)、全基因組的表觀狀態(tài)改變及基因的轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。對(duì)重編程過(guò)程中染色質(zhì)修飾因子的進(jìn)一步了解可能對(duì)iPSCs的應(yīng)用起積極的作用?，F(xiàn)就染色質(zhì)修飾因子在iPSCs重編程中的研究進(jìn)展予以綜述。

1多能性干細(xì)胞和體細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)

1.1多能性干細(xì)胞的開(kāi)放染色質(zhì)狀態(tài)及其特異性標(biāo)記真核細(xì)胞的DNA和組蛋白結(jié)合在一起構(gòu)成染色質(zhì)，在這種環(huán)境下進(jìn)行基因表達(dá)和細(xì)胞命運(yùn)決定。許多干祖細(xì)胞的組織學(xué)切片都被描述為具有典型的松弛而開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，并缺乏致密異染色質(zhì)[3]。隨著研究的深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，多能性干細(xì)胞的染色質(zhì)處于開(kāi)放狀態(tài)，其染色質(zhì)總體結(jié)構(gòu)松散，常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的比例明顯高于分化后的細(xì)胞[4]。用核酸酶分析全基因組緊縮狀態(tài)顯示，胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)比其分化后細(xì)胞的對(duì)核酸酶敏感性更高，說(shuō)明其染色質(zhì)可接近性高，染色質(zhì)松弛而開(kāi)放[5]。

應(yīng)用DNA甲基化測(cè)序和組蛋白修飾的特異性抗體對(duì)比分析多能性干細(xì)胞和分化后細(xì)胞的表觀狀態(tài)發(fā)現(xiàn)了一些開(kāi)放狀態(tài)染色質(zhì)和關(guān)閉狀態(tài)染色質(zhì)的一些特異標(biāo)記[6]：開(kāi)放狀態(tài)染色質(zhì)通常是DNA低甲基化、組蛋白H3/H4ac、H3K4me3，而關(guān)閉狀態(tài)染色質(zhì)則是DNA高甲基化、H3K9me2/3和H3K27me3、富含異染色質(zhì)蛋白1。

1.2染色質(zhì)修飾因子、開(kāi)放染色質(zhì)與重編程的關(guān)系處于開(kāi)放狀態(tài)的多能性干細(xì)胞染色質(zhì)，能允許轉(zhuǎn)錄程序迅速向分化轉(zhuǎn)變。這對(duì)于多能性干細(xì)胞尤為重要，因?yàn)樗峁┝耸謴V泛的分化程序選擇范圍[7]。體細(xì)胞重編程為多能性的過(guò)程，細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)由關(guān)閉的緊縮向開(kāi)放的松弛狀態(tài)發(fā)生劇烈轉(zhuǎn)變，在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的染色質(zhì)修飾因子扮演不可或缺的角色。已有許多研究通過(guò)過(guò)表達(dá)或基因敲減(敲除)來(lái)研究其在此過(guò)程中的作用機(jī)制。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；?、CRCs等在重編程過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2DNA甲基化和去甲基化

在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化酶誘導(dǎo)激活DNA脫氨酶在細(xì)胞重編程過(guò)程中對(duì)于OCT4和NANOG的表達(dá)是必需的[8]。重編程過(guò)程中用5-氮雜胞苷抑制DNA甲基化能使iPSCs實(shí)現(xiàn)完全重編程并提高重編程效率[9]。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，DNA去甲基化是重編程中不得不逾越的一個(gè)重要障礙。

2.1DNA甲基化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄DNA甲基化是指在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上發(fā)生甲基化的共價(jià)修飾。哺乳動(dòng)物中，主要通過(guò)三種酶進(jìn)行DNA甲基化修飾：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1，DNMT3A和DNMT3B[10]。DNMT1維持基因組區(qū)域或子代細(xì)胞中DNA的甲基化狀態(tài)，DNMT3A/3B是重新發(fā)生DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，即使未甲基化的胞嘧啶發(fā)生甲基化。DNA甲基化通常被認(rèn)為與基因表達(dá)沉默相關(guān)。如NANOG基因的啟動(dòng)子區(qū)域在體細(xì)胞中是高甲基化的，而在ESCs中則是未甲基化的[11]。Mikkelsen等[9]發(fā)現(xiàn)，DNA的甲基化與處于抑制狀態(tài)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)。這可能是DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的原因，因?yàn)榘l(fā)生甲基化的元件的可接近性降低，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。

2.2DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)于體細(xì)胞重編程必不可少在iPSC的重編程的過(guò)程中DNA的甲基化狀態(tài)需要由體細(xì)胞狀態(tài)逐漸向多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變。研究者通過(guò)抑制或敲減DNMT1，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平下降，重編程進(jìn)程得以促進(jìn)，說(shuō)明DNMT1活性的抑制在iPSCs重編程過(guò)程中是十分重要的[9]。另有研究表明，DNMT3A/3B對(duì)于重編程并不是必需的，盡管產(chǎn)生的iPSCs 只有當(dāng)DNMT3A/3B重新被轉(zhuǎn)到細(xì)胞中才能獲得真正的發(fā)育潛能[12]。在iPSCs的傳代過(guò)程中直到其DNA甲基化狀態(tài)完全發(fā)生轉(zhuǎn)變，其多能性狀態(tài)才能確定，即發(fā)生完全重編程[13]。

研究者發(fā)現(xiàn)一些調(diào)控DNA甲基化的基因(如Tet1、Tet2、Tet3和Parp1等)對(duì)于iPSC的產(chǎn)生是必不可少的：同時(shí)敲除Tet1、Tet2、Tet3則iPSCs重編程不能實(shí)現(xiàn)[14]。對(duì)重編程機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn),Tet2和Parp1能促進(jìn)Oct4結(jié)合到Nanog和Esrrb區(qū)域而促進(jìn)重編程的發(fā)生[15]。TET1則被招募到NANOG的結(jié)合區(qū)域增強(qiáng)一系列關(guān)鍵基因的表達(dá)從而促進(jìn)重編程進(jìn)程[16]。

2.3DNA甲基化相關(guān)小分子影響重編程研究還發(fā)現(xiàn)一些小分子化合物通過(guò)改變DNA甲基化影響iPSCs的重編程過(guò)程。維生素C促進(jìn)重編程的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)其可能是通過(guò)DNA去甲基化酶Tet家族發(fā)揮作用[17]。valproic acid(丙戊酸)能特異地抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶的活性，從而提高iPSCs的重編程效率[18]。Butyrate(丁酸鹽)促進(jìn)人iPSCs 的重編程可能是通過(guò)促進(jìn)DNA去甲基化酶和H3乙酰化酶的表達(dá)而使內(nèi)源性多能性基因(如OCT4和DPPA2)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的[19]。

3組蛋白修飾

組蛋白修飾是指在構(gòu)成染色質(zhì)的核心組蛋白尾巴上進(jìn)行甲基化、乙?；⒎核鼗?、磷酸化等共價(jià)修飾。染色質(zhì)的組蛋白修飾改變將直接影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)并調(diào)控基因表達(dá)。Koche等[20]在研究重編程早期轉(zhuǎn)錄和表觀修飾改變時(shí)發(fā)現(xiàn)，重編程早期染色體上有1000多個(gè)區(qū)域發(fā)生H3K4me2的組蛋白修飾，它們主要集中在多能性和發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子上。

3.1組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶與重編程進(jìn)程組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中的兩個(gè)重要家族PcG和TrxG是細(xì)胞分化和重編程過(guò)程中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。PcG蛋白與基因沉默和異染色質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)，包括多梳抑制復(fù)合物1和多梳抑制復(fù)合物2。多梳抑制復(fù)合物2的兩個(gè)亞單位Suz12和Eed使染色質(zhì)標(biāo)記H3K27me3，多梳抑制復(fù)合物1識(shí)別并結(jié)合到這些修飾區(qū)域，并促使抑制標(biāo)記H2AK119ub形成[21]。TrxG則是在基因的啟動(dòng)子上維持轉(zhuǎn)錄活化的H3K4me3標(biāo)記[22]。TrxG復(fù)合體的核心組分Wdr5在iPSCs的重編程過(guò)程中被激活，它能直接結(jié)合到多能性基因啟動(dòng)子上調(diào)控多能性基因轉(zhuǎn)錄，重編程中敲減Wdr5則使重編程效率的顯著下降[23]。

H3K27去甲基化酶Utx和Jmjd3是重編程過(guò)程中不依賴PcG/TrxG的組蛋白修飾酶。Utx在重編程過(guò)程中能去除體細(xì)胞中H3K27me3，與OCT4、SOX2及KLF4(Kruppel-like factor 4)共同確定多能性狀態(tài)[24]。Jmjd3能抑制iPSCs的重編程，可能與PHF20的泛素化相關(guān)。PHF20本身對(duì)于iPSCs的產(chǎn)生十分關(guān)鍵，并能與Wdr5相互作用調(diào)控基因表達(dá)[25]。

Onder等[26]通過(guò)shRNA研究重編程過(guò)程中的染色質(zhì)修飾酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些影響重編程效率的染色質(zhì)修飾酶，如敲減組蛋白修飾酶SUV39H1及DOT1L能使重編程效率提高1倍。對(duì)H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶DOT1L的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制DOT1L能顯著減少譜系特異基因上的H3K79me2水平，從而抑制其轉(zhuǎn)錄并提高重編程效率[26]。而使用小分子BIX-01294 抑制H3K9me甲基轉(zhuǎn)移酶G9a也能促進(jìn)iPSCs的產(chǎn)生[27]。

3.2組蛋白乙?；c重編程密切相關(guān)組蛋白乙酰化是染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域的標(biāo)記，主要是通過(guò)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰化酶調(diào)節(jié)。在ESCs多能性相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白是高乙?；腫28]。更重要的是，去乙?；敢种苿┠茱@著提高iPSCs重編程效率。在iPSC重編程的過(guò)程中使用組蛋白去乙?；敢种苿┍焖岷颓啪谹阻止組蛋白的去乙酰化提高iPSC的重編程效率[29]。而單獨(dú)使用丙戊酸處理體細(xì)胞(未轉(zhuǎn)重編程因子)也能使多能性基因表達(dá)上調(diào)[29]。精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AMI-5和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β抑制劑A-83-01能促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs的過(guò)程[30]。組蛋白去乙?；敢种苿〣utyrate能使人成纖維細(xì)胞重編程效率提高50倍[31]。

4CRCs

CRCs能特異地結(jié)合到染色質(zhì)上改變核小體的分布，進(jìn)而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，這是與DNA甲基化及組蛋白修飾不同的基因調(diào)控機(jī)制。ATP依賴的CRCs包括ISWI、染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白(chromodomain helicase DNA-binding protein，CHD)、INO80和SWI/SNF復(fù)合體4類。CRCs通常包括一個(gè)SWI2/SNF2 ATP酶結(jié)構(gòu)域，一個(gè)染色質(zhì)識(shí)別亞單位，及與其他蛋白結(jié)合的調(diào)控亞單位。

4.1SWI/SNF復(fù)合體協(xié)同多能性轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)重編程進(jìn)程SWI/SNF復(fù)合體在細(xì)胞分化和重編程過(guò)程中的關(guān)鍵作用可能是它能增強(qiáng)重編程因子結(jié)合到多能性相關(guān)基因啟動(dòng)子上而提高重編程效率。Brg1/Brm相關(guān)因子( Brg1/Brm associated factor，BAF)及PBAF復(fù)合體是SWI/SNF中的主要成員，至少由12個(gè)蛋白亞基組成。在不同的細(xì)胞中BAF或PBAF復(fù)合體的組成有差異，如在ESCs中BAF復(fù)合體包括Brg1、BAF60a、BAF155，而缺少Brm、BAF60c、BAF170[32]。過(guò)表達(dá)Brg1和BAF155能替代c-MYC,激活內(nèi)源性的OCT4的表達(dá)并使體細(xì)胞完全重編程為多能性狀態(tài)[33]。其機(jī)制是，BRG1和BAF155能提高多能性相關(guān)基因啟動(dòng)子上活化標(biāo)記H3K4me3和H3K9ac的水平，并減低抑制標(biāo)記H3K27me3的水平。Mak等[34]通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用研究發(fā)現(xiàn)，BRG1及BRM復(fù)合體與KLF4相互作用促進(jìn)體細(xì)胞重編程為iPSCs。在第二代的小鼠成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BRG1或BRM能使重編程效率提高2～7倍，而用shRNA對(duì)其進(jìn)行敲減將使重編程效率下降50%以上[34]。

4.2CHD家族與重編程過(guò)程在CHD家族中發(fā)現(xiàn)有4個(gè)染色質(zhì)重塑酶與多能性相關(guān)：CHD1、CHD3、CHD4和CHD7。在ESCs中進(jìn)行的RNAi篩查實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),染色質(zhì)重塑酶CHD1對(duì)于維持OCT4等多能性因子的表達(dá)發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)也使其染色質(zhì)維持一個(gè)開(kāi)放的狀態(tài)。在重編程過(guò)程中敲減CHD1能使重編程效率下降50%以上[35]。而CHD7對(duì)于ESCs向神經(jīng)脊分化是必需的，其機(jī)制是通過(guò)與PBAF復(fù)合體相互作用而影響其向神經(jīng)脊分化的[36]。CHD3和CHD4構(gòu)成核小體重塑(NuRD)復(fù)合體的催化亞基，在ESCs中發(fā)揮作用。Mbd3是核小體重塑和去乙?；笍?fù)合體的核心單位，在iPSCs重編程過(guò)程中敲減Mbd3能使iPSCs重編程效率近乎達(dá)到100%[37]。

INO80和ISWI家族在ESCs中主要與多能性和自我更新相關(guān)，它們?cè)谥鼐幊讨械淖饔糜写M(jìn)一步的研究[38-39]。總之，以上對(duì)CRCs的研究將染色質(zhì)修飾或結(jié)構(gòu)的改變與多能性轉(zhuǎn)錄程序和體細(xì)胞的重編程、多能性干細(xì)胞的分化聯(lián)系在一起。這不僅說(shuō)明了CRCs在重編程和多能性中的重要作用，同時(shí)也提示其在多能性開(kāi)放染色質(zhì)維持、細(xì)胞分化中可能扮演更為重要而廣泛的作用。

5結(jié)語(yǔ)

至今為止，iPSCs的重編程是依賴于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上，從而能改變細(xì)胞命運(yùn)。而這種改變細(xì)胞命運(yùn)的方法依賴并被染色質(zhì)的狀態(tài)調(diào)控因子所促進(jìn)。對(duì)普遍的轉(zhuǎn)錄機(jī)制相關(guān)組分的研究發(fā)現(xiàn)，它們不僅能影響重編程的效率，并且對(duì)于重編程過(guò)程十分關(guān)鍵。這暗示調(diào)控細(xì)胞重編程上存在不同層次的機(jī)制。隨著細(xì)胞重編程方法變得越來(lái)越成熟和多樣，對(duì)于重編程的生物學(xué)機(jī)制研究會(huì)變得更加快速和清晰。多能性細(xì)胞分化和重編程過(guò)程中動(dòng)態(tài)表觀遺傳圖譜的繪制也將提供細(xì)胞重編程中染色質(zhì)水平上的作用機(jī)制。

目前對(duì)重編程過(guò)程中的染色質(zhì)修飾因子研究主要集中在：①發(fā)現(xiàn)影響重編程的新的染色質(zhì)修飾因子；②染色質(zhì)修飾因子影響重編程的機(jī)制研究；③染色質(zhì)修飾因子與轉(zhuǎn)錄因子在重編程中的相互作用對(duì)表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的影響。對(duì)iPSC重編程中染色質(zhì)修飾因子的研究不僅加深了對(duì)重編程和細(xì)胞命運(yùn)決定的了解，同時(shí)對(duì)于多能性干細(xì)胞定向誘導(dǎo)用于臨床應(yīng)用都有極大的促進(jìn)作用。

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Research Progress of Chromatin Modifying Factors in Induced Pluripotent Stem Cells Reprogramming

WUXing-wu1,LINGe1,2,HULiang1,2.

(1.InstituteofReproductive&StemCellEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410000,China; 2.NationalEngineeringandResearchCenterofHumanStemCell,Changsha410000,China)

Abstract:Induced pluripotent stem cells(iPSCs) have wide application prospect in regeneration medicine because of its unique advantages.In recent years,a series of studies have discovered the chromatin modifying factors play indispensible roles both in stemness maintaining and somatic cell reprogramming process.In reprogramming process,inhibiting some chromatin modifying enzymes can improve the reprogramming efficiency,while knockdown or knockout of the chromatin modifying factors would result in retardation or failure of reprogramming process.Here is to make a review of the characteristics and mechanism of recently disco-vered chromatin modifying factors which play important roles in the process of iPSCs reprogramming.

Key words:Reprogramming; Chromatin modifying factors; Induced pluripotent stem cells

收稿日期：2014-05-19修回日期：2014-08-29編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81372627)；湖南省自然科學(xué)基金(13JJ3038)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.08.001

中圖分類號(hào)：R394

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)08-1345-04