4種中草藥提取物對(duì)水霉的體外抑菌試驗(yàn)

藺凌云等

摘 要：實(shí)驗(yàn)采用生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定了五倍子、黃連、黃芩及烏梅4種中草藥的提取物對(duì)水霉菌絲及游動(dòng)孢子的抑制作用。結(jié)果表明，4種中草藥的提取物對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)及游動(dòng)孢子的萌發(fā)均有一定程度的抑制作用。其中以黃芩的乙酸乙酯提取物對(duì)水霉菌絲的生長(zhǎng)抑制作用最顯著，0.1mg/mL時(shí)抑制效率為83%，0.5mg/mL時(shí)可完全抑制水霉菌絲的生長(zhǎng)。黃芩的乙酸乙酯及無(wú)水乙醇提取物在濃度為0.4mg/mL，可使80%的水霉游動(dòng)孢子萌發(fā)被抑制。

關(guān)鍵詞：中草藥；抑菌；水霉病

中圖分類(lèi)號(hào) S943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）02-11-03

Abstract：The inhibition effects of 4 kinds of Chinese herb medicines，such as Nutgall，Rhizoma Coptidis，Radix scutellariae and Dark plum，on Saprolegia zoospore and mycelium in vitro were studied. The results showed that all the extracts of 4 kinds of Chinese herb medicines had inhibitory action on both Saprolegia mycelial growth and zoospore germination in different degree. Furthermore，the results also show that the ethyl acetate extract of radix scutellariae had the most significant inhibition. It presented a 83% fungistatic rate at a concentration of 0.1mg/mL and could be killed the Saprolegia mycelium above 0.5mg/mL. The activity of 80% of the Saprolegia zoospore could be significantly inhibited by ethanol and ethyl acetate extraction of radix scutellariae when the application concentration at 0.4mg/mL.

Key words：Chinese herb medicines；Antibacterial activity；Saprolegia

水霉病是淡水動(dòng)物的常見(jiàn)病害之一，其病原水霉（Saprolegnia）隸屬于茸鞭生物界（Stramenopila）、卵菌綱（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、水霉科（Sprolegniaceae）[1]。可感染草魚(yú)、鯽魚(yú)、花鱸、大銀魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾鮰、大鯢、黃鱔、烏鱧、虹鱒、月鱧、中華絨鰲蟹等[2-4]眾多淡水養(yǎng)殖動(dòng)物。通常健康魚(yú)體及魚(yú)卵對(duì)水霉病原的侵染具有較強(qiáng)的抵抗能力，但是在高密度養(yǎng)殖條件下，魚(yú)體間相互摩擦后造成的損傷、應(yīng)激作用及水質(zhì)條件的惡化，均會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體的抗感染能力降低，使得魚(yú)體更易感染水霉，因此冬末春初氣溫起伏較大的季節(jié)，往往是水霉病的高發(fā)期。水霉主要寄生在魚(yú)體傷口和死卵上，危害養(yǎng)殖魚(yú)體和降低魚(yú)卵孵化率，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。以前孔雀石綠是治療水霉病的有效藥物，但由于該藥具有“三致”，高毒性，高殘留等問(wèn)題，2002年農(nóng)業(yè)部已將其列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》[5-7]。生產(chǎn)上雖然也使用氯化鈉、福爾馬林、過(guò)氧化氫、臭氧、腐植酸、二氧化氯、溴硝丙二醇等化學(xué)替代品進(jìn)行水霉病的防治，但是這些藥物由于缺乏高效性或其安全風(fēng)險(xiǎn)較高而未得到廣泛認(rèn)可[8-11]。中草藥具有安全、有效、毒副作用小、無(wú)二次污染、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，有關(guān)中草藥防治水產(chǎn)動(dòng)物水霉病已有先例[12-14]。筆者在前期工作中發(fā)現(xiàn)4種對(duì)水霉具有較強(qiáng)抑菌作用的中草藥，為了進(jìn)一步研究其主要活性成分，采用系統(tǒng)溶劑極性法對(duì)這4種中草藥進(jìn)行提取，通過(guò)水霉菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的抑制效果測(cè)定，初步確定抑菌活性部位，為進(jìn)一步分離抑菌活性成分，開(kāi)發(fā)新的水霉病防治藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 五倍子、黃連、黃芩、烏梅均購(gòu)自湖州市慕韓齋中藥店，水霉菌株分離于患病的異育銀鯽，為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 儀器與試劑 FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)，熱回流提取裝置，R-210/215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi），Olympus-BX51顯微鏡（日本）。無(wú)水乙醇（分析純），乙酸乙酯（分析純），石油醚（分析純）均購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 五倍子、黃連等中草藥粗提物的制備 中草藥經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，分裝到廣口瓶中備用。稱(chēng)取經(jīng)粉碎的各種中草藥粉末5份各20g，分別用6～8倍的石油醚（沸程60～90℃）、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇和水回流提取3次，每次2h，合并各提取液，減壓濃縮至浸膏，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 藥物對(duì)水霉菌絲的抑制效果 挑取保存于試管內(nèi)的水霉菌絲接種于PDA平板，25℃培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿平板。將供試藥物用20%二甲亞砜溶解后，制成不同濃度的含藥平板，以加入等量20%二甲亞砜的平板為對(duì)照。將打孔器制備的直徑1cm的菌餅置于PDA平板中央，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，25℃恒溫培養(yǎng)48h后，用十字交叉法測(cè)量其在含不同藥劑濃度的培養(yǎng)基上菌落直徑并與對(duì)照比較，計(jì)算各藥劑處理對(duì)菌落擴(kuò)展的生長(zhǎng)抑制率。抑菌率（%）=[（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）]/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.3.3 藥物對(duì)水霉孢子萌發(fā)的最小抑菌濃度測(cè)定 水霉孢子懸浮液的制備參考夏文偉等的方法。即將1.3.3中活化的菌株，轉(zhuǎn)接至新的PDA平板，并在菌餅四周放置滅菌的油菜籽，待油菜籽長(zhǎng)滿菌絲后將其取出置于滅菌河水中，25℃培養(yǎng)直至產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子。然后用3層無(wú)菌紗布過(guò)濾制成終濃度為5×103個(gè)/mL的孢子懸液。取0.1mL水霉孢子懸液涂布含各濃度藥物的PDA平板。25℃培養(yǎng)2d。每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)對(duì)照，空白對(duì)照為加入等量20%的二甲亞砜平板。顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況。以80%以上的孢子被抑制萌發(fā)的最小藥物濃度作為MIC80。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種中草藥提取物對(duì)水霉菌絲生長(zhǎng)的抑制效果比較 4種中草藥不同溶劑提取物的抑菌作用見(jiàn)表1。由表1可知，五倍子粗提物濃度小于0.2mg/mL時(shí)均對(duì)水霉菌絲的擴(kuò)展沒(méi)有任何抑制能力，0.5mg/mL及以上才表現(xiàn)出一定的抑制效果，其中無(wú)水乙醇>水>乙酸乙酯>石油醚。黃連各溶劑粗提物的抑菌效果：無(wú)水乙醇>水>乙酸乙酯>石油醚，濃度越高抑菌力越強(qiáng)。黃芩各溶劑粗提物均有較好的抑菌效果，其中以乙酸乙酯水粗提物抑制效果最好，0.1mg/mL時(shí)抑制率可達(dá)83%，0.5mg/mL則完全抑制菌絲的擴(kuò)展。無(wú)水乙醇粗提物的抑制效果次之，低濃度效果比較明顯，0.1mg/mL抑制率為66%，當(dāng)濃度增至1.5mg/mL時(shí)抑菌效果增強(qiáng)并不顯著，僅為87%。黃芩水粗提物在濃度0.1～1.5mg/mL時(shí)，抑制率在55%～61%。烏梅的乙酸乙酯及無(wú)水乙醇粗提物的抑菌效果略強(qiáng)于石油醚及水粗提物。雖然各粗提物在0.1mg/mL時(shí)的最低抑菌率為24%，但是藥物濃度提高至1.5mg/mL時(shí)的最高抑菌率僅為73%。

3 結(jié)論與討論

植物中化學(xué)成分十分復(fù)雜，在提取植物有效成分時(shí)，若僅用某一種溶劑不可能將植物的組成成分都提取出來(lái)，因此有必要采用極性由弱到強(qiáng)的幾種不同溶劑對(duì)同一植物進(jìn)行提取，使各成分依其在不同極性溶劑中的溶解度差異而分離出來(lái)，從而避免最強(qiáng)活性物質(zhì)的“漏篩”。本研究通過(guò)石油醚、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇和水4種溶劑對(duì)五倍子、黃連、黃芩、烏梅等進(jìn)行系統(tǒng)提取，并通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)，進(jìn)行藥效活性追蹤。結(jié)果表明，五倍子的活性成分主要存在于無(wú)水乙醇提取物；黃連對(duì)限制菌絲生長(zhǎng)的活性成分主要存在無(wú)水乙醇提取物，而乙酸乙酯提取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最明顯；黃芩的活性成分主要存在于乙酸乙酯提取物；烏梅有效成分的分離效果不理想，乙酸乙酯、無(wú)水乙醇及水提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的限制作用差別不大，無(wú)水乙醇提取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用好于其他3種溶劑。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩的乙酸乙酯提取物對(duì)供試水霉菌株菌絲及孢子的抑制效果最顯著，但該活性部位仍然為含有多種成分的混合物，還需要通過(guò)活性追蹤的方法進(jìn)一步研究，最終獲取水霉抑菌活性單體成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系進(jìn)行分析。所以本研究可為魚(yú)類(lèi)水霉病的下一步進(jìn)行防治水霉活性物質(zhì)的分離、鑒定，以及仿生合成，最終實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)抗真菌漁藥的產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎(chǔ)，也可為開(kāi)發(fā)無(wú)公害殺蟲(chóng)漁藥提供思路。

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（責(zé)編：張宏民）