閆玉鑫

(云南師范大學(xué) 職業(yè)技術(shù)教育學(xué)院，云南 昆明 650092)

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川黃柏的抗腫瘤化學(xué)成分研究

閆玉鑫

(云南師范大學(xué) 職業(yè)技術(shù)教育學(xué)院，云南 昆明 650092)

應(yīng)用現(xiàn)代方法對(duì)川黃柏中化學(xué)成分及其體外抗腫瘤作用進(jìn)行研究.從川黃柏中分離鑒定了7個(gè)已知化合物，分別為小檗堿(1)、巴馬汀(2)、10，11-二甲氧基-13-甲基小檗堿(3)、丁香脂素O-β-D葡萄糖苷(4)、紫丁香酚苷(5)及常見(jiàn)的β-谷甾醇(6)和β-胡蘿卜苷(7).以HepG2、MCF7、HT29和MKN28腫瘤細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用MTT法研究了化合物的體外抗腫瘤活性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物1和3具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的作用，IC50值分別為0.15和0.19 μM.表明川黃柏中得到的化合物對(duì)不同種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒選擇性，有一定的抗癌活性.

川黃柏；小檗堿；化學(xué)成分；抗腫瘤活性

川黃柏(Phellodendron chinense Schneid.)來(lái)源于蕓香科黃柏屬植物，為喬木，主要分布于我國(guó)的陜西和四川[1].其性苦、寒，具有清熱消腫止痛等作用，很多歷史文獻(xiàn)中都有黃柏入藥的記載，現(xiàn)代藥理研究表明川黃柏在降血糖[2]、抗菌消炎[3]、抗癌[4]及免疫系統(tǒng)疾病[5]等方面有獨(dú)特的療效.有關(guān)川黃柏的研究主要集中在藥理作用與臨床應(yīng)用，化學(xué)成分報(bào)道的極少.因此，我們對(duì)川黃柏的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離并鑒定了7個(gè)化合物，分別為小檗堿(1)[6]、巴馬汀(2)[7]、10，11-二甲氧基-13-甲基小檗堿(3)[8]、丁香脂素O-β-D葡萄糖苷(4)[9]、紫丁香酚苷(5)[10]以及常見(jiàn)的β-谷甾醇(6)和β-胡蘿卜苷(7).化合物3-5首次從該植物中分離得到.

1 儀器與材料

1.1 藥材

川黃柏于2011年2月購(gòu)買于陜西西安藥材市場(chǎng)，經(jīng)昆明植物所李錫文教授鑒定為蕓香科黃柏屬植物川黃柏(Phellodendron chinense Schneid.)的莖.

1.2 儀器

質(zhì)譜由英國(guó)Micromass產(chǎn)VG Autospec-3000質(zhì)譜儀測(cè)定；NMR譜由Bruker AV-400和DRX-500核磁共振儀測(cè)定，四甲基硅烷 (TMS)為內(nèi)標(biāo)；芬蘭Labsystems MK3酶標(biāo)儀；美國(guó)Revco CO2培養(yǎng)箱；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；RPMI-1640為Gibco公司產(chǎn)品.

1.3 材料

柱色譜用硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)(200-300 目)；反相硅膠為Merk公司生產(chǎn)Lichroprep RP-18 (40-63 μm)；Sephadex LH-20為Pharmacia公司產(chǎn)品；薄層色譜材料為青島海洋化工廠生產(chǎn)的硅膠G和GF254型硅膠；生物堿顯色劑為自配的改良碘化鉍鉀試劑.

2 提取和分離

川黃柏莖干燥粉碎成粉末(30.0 kg)經(jīng)95%甲醇加熱回流提取三次(3×50 L，8 h)，合并提取液并濃縮，加酸水5 000 mL稀釋，分別用乙酸乙酯萃取三次，得到非生物堿部分.酸水液堿化至pH=10.0，用氯仿萃取三次得到生物堿部分(280 g).氯仿萃取部分反復(fù)上硅膠柱層析，SephadexLH-20，RP-18硅膠柱層析得到化合物1(18 g)、2(25 mg)、3(9 mg)、4(13 mg)、5(26 mg)、6(28 mg)、7(7 g).

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色針狀結(jié)晶(CH3OH)，改良碘化鉍鉀試劑反應(yīng)陽(yáng)性；分子式C20H18NO4，EI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰 m/z：337[M+H]+；1H，13C NMR(ppm，CD3OD)：H6.96(1H，s，H-1)，7.65(1H，s，H-4)，9.77(1H，s，H-8)，8.00(1H，d，J=9.1，H-11)，8.11(1H，d，J=9.1，H-12)，8.70(1H，s，H-13)，6.10(2H，s，O-CH2-O)，4.10，4.20(6H，各s，2×OCH3).C106.5(d，C-1)，152.2(s，C-2)，149.9(s，C-3)，109.4(d，C-4)，131.9(s，C-4a)，28.2(t，C-5)，57.2(t，C-6)，146.4(d，C-8)，121.9(s，C-8a)，152.0(s，C-9)，145.7(s，C-10)，124.5(d，C-11)，121.5(d，C-12)，135.1(s，C-12a)，128.0(d，C-13)，139.7(s，C-14)，123.3(s，C-14a)，103.7(t，O-CH2-O)，62.5，57.6(q，2×OCH3).以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的小檗堿基本一致.

化合物2：桔黃色結(jié)晶(CH3OH)，改良碘化鉍鉀試劑反應(yīng)陽(yáng)性；分子式C21H22NO4，EI-MS譜給出準(zhǔn)分子離子峰m/z：353[M+H]+；1H，13C NMR(ppm，CD3OD)：H7.02(1H，s，H-1)，7.61(1H，s，H-4)，9.74(1H，s，H-8)，8.00(1H，d，J=8.5，H-11)，8.08(1H，d，J=8.5，H-12)，8.72(1H，s，H-13)，3.92，3.97，4.08，4.19(12H，各s，4×OCH3).C109.8(d，C-1)，151.9(s，C-2)，153.7(s，C-3)，112.1(d，C-4)，135.1(s，C-4a)，27.8(t，C-5)，56.6(t，C-6)，145.6(d，C-8)，120.4(s，C-8a)，150.8(s，C-9)，146.3(s，C-10)，124.5(d，C-11)，121.2(d，C-12)，130.0(s，C-12a)，127.9(d，C-13)，139.7(s，C-14)，123.2(s，C-14a)，62.5，57.6，57.3，57.0(q，4×OCH3).綜合以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，鑒定化合物2為巴馬汀(palmatine).

化合物3：黃色針狀結(jié)晶(CH3OH)，改良碘化鉍鉀試劑反應(yīng)陽(yáng)性，分子式C21H20NO4，EI-MS譜給出離子峰m/z：351[M+H]+；1H，13C NMR(ppm，CD3OD)：H7.02(1H，s，H-1)，7.33(1H，s，H-4)，9.76(1H，s，H-8)，8.13(1H，s，H-9)，8.12(1H，s，H-12)，6.10(2H，s，O-CH2-O)，4.07，4.15(6H，各s，2×OCH3)，1.27(3H，s，CH3).C109.2(d，C-1)，151.9(s，C-2)，148.5(s，C-3)，111.7(d，C-4)，131.8(s，C-4a)，29.1(t，C-5)，57.5(t，C-6)，145.0(d，C-8)，122.6(s，C-8a)，122.1(d，C-9)，151.2(s，C-10)，146.1(s，C-11)，127.1(d，C-12)，134.8(s，C-12a)，135.1(s，C-13)，137.9(s，C-14)，121.9(s，C-14a)，103.6(t，O-CH2-O)，62.6，58.5(q，2×OCH3)，18.2(q，CH3).以上數(shù)據(jù)與報(bào)道的已知化合物10,11-dimethoxy-13-methylprotoberberinium數(shù)據(jù)基本一致[8]，故鑒定該化合物為10，11-二甲氧基-13-甲基小檗堿.

化合物4：白色粉末，分子式C28H36O13，負(fù)離子FAB-MS顯示m/z 580；1H，13C NMR：H6.62(2H，s，H-2'，6')，3.74(3H，s，O-CH3')，6.58(2H，s，H-2''，6'')，5.00(d，J=5.2，Glu-H).C54.2(d，C-1)，86.0(d，C-2)，71.8(t，C-4)，54.0(d，C-5)，85.6(d，C-6)，71.6(t，C-8)，131.3(s，C-1')，102.9(d，C-2'，6')，147.3(s，C-3'，5')，134.4(s，C-4')，56.3(q，OCH3')，131.3(s，C-1'')，102.7(d，C-2''，6'')，152.7(s，C-3''，5'')，138.2(s，C-4'')，56.2(q，OCH3'')，Glu：105.5(d，C-1)，74.0(d，C-2)，76.3(d，C-3)，69.5(d，C-4)，75.9(d，C-5)，61.5(t，C-6).波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]一致，確定化合物4為丁香脂素O-β-D葡萄糖苷.

化合物5：白色粉末，分子式C34H46O18，EI-MS顯示m/z 418，負(fù)離子FAB-MS顯示m/z 741[MPhellodendron chinense；Berberine；Chemical constituents；Anti-tumorH]-；1H，13C NMR：H6.64(4H，s，H-2'，2''，6'，2'')，3.74(12H，s，4×OCH3)，5.00(2H，d，J=5.2，2×Glc-H).C53.7(d，C-1)，85.2(d，C-2)，70.0(t，C-4)，133.7(s，C-1')，104.2(d，C-2'，6')，152.7(s，C-3'，5')，137.2(s，C-4')，56.5(q，OCH3')，Glc：102.7(d，C-1)，74.2(d，C-2)，77.3(d，C-3)，71.5(d，C-4)，76.6(d，C-5)，61.0(t，C-6).與文獻(xiàn)[10]一致，確定化合物5為紫丁香酚苷.

β-谷甾醇(6)：無(wú)色針晶(氯仿)，TLC與標(biāo)準(zhǔn)品β-谷甾醇Rf值一致.

β-胡蘿卜苷(7)：白色粉末，TLC與標(biāo)準(zhǔn)品β-胡蘿卜苷Rf值一致.

4 體外抗腫瘤細(xì)胞活性試驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞(HepG2)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF7)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT29)和人胃癌細(xì)胞(MKN28)以每孔0.19 mL的量分別接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)為0.4×104/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h待貼壁后，分別加入10 μL不同濃度的藥物，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，藥物作用72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT，繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4 h，傾去培養(yǎng)液，加入DMSO 0.1 mL，用酶聯(lián)儀以570 nm 測(cè)定去除本底光吸收值后的吸收度(A)值，并以Bliss計(jì)算IC50值，IC50=(1-樣品的A值/對(duì)照組的A值)×100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 化合物 1-5 的細(xì)胞毒活性(IC50μM)Table 1 Cytotoxicity of compounds 1-5(IC50μM)

5 討 論

實(shí)驗(yàn)從川黃柏中得到7個(gè)已知化合物，包括3個(gè)原小檗堿型生物堿、2個(gè)木質(zhì)素苷、2個(gè)甾醇類化合物，化合物3-5為首次從該植物中得到.對(duì)從黃柏中得到的部分化合物進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，大部分化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性十分明顯；化合物1對(duì)人胃癌細(xì)胞株有一定的細(xì)胞毒活性，其余化合物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株、人結(jié)腸癌細(xì)胞株和人胃癌細(xì)胞株細(xì)胞毒活性不明顯.

綜上所述，所得化合物對(duì)不同種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒選擇性，其抗癌作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系需要更深一步進(jìn)行研究.本研究從化合物單體水平進(jìn)一步證明了藥用植物川黃柏具有一定的抗癌活性，為合理開發(fā)利用該植物奠定了理論基礎(chǔ).

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編寫委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

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Anticancer Activity of Constituents from Phellodendron chinense

YAN Yu-xin

(College of Vocational and Technical Education,Yunnan Normal University,Kunming 650092,China)

Various techniques were used to study the chemical constituents and the anti-tumor effect of the plant Phellodendron chinense.Seven compounds were isolated and identified as berberine(1),palmatine(2),10,11-dimethoxy-13-methylprotoberberinium(3),syringaresinol-4-O-β-D-monoglycoside(4),syringiaresinoldiglycoside(5),β-sitosterol(6),β-daucosterol(7).The inhibitory effects of these compounds on HepG2,MCF7,HT29 and MKN28 cell lines were tested in vitro by MTT method.Compounds 1 and 3 exhibit potent effect against HepG2, with IC50values of 0.15 and 0.19 μM,respectively.The study suggests that the compounds from Phellodendron chinense have the anti-tumor effects and these cytotoxic activities on different tumor cell lines are various and selective.

Phellodendron chinense；Berberine；Chemical constituents；Anti-tumor

2015-03-19

云南省教育廳基金資助項(xiàng)目(2014Y146).

閆玉鑫(1982-)，女，山東菏澤人，講師，主要從事次生代謝產(chǎn)物方面研究.

閆玉鑫.

R284

A

1007-9793(2015)03-0075-04