羅 維，張 鵬，艾 磊，周 越，陳曉萍

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不同濃度紅景天苷對(duì)成肌細(xì)胞體外分化的影響及機(jī)制初探

羅 維1，張 鵬2，艾 磊3，周 越4，陳曉萍2

研究目的：探討不同濃度紅景天苷對(duì)成肌細(xì)胞株C2C12體外分化的影響及可能機(jī)制，有望為成肌細(xì)胞增殖分化尋求更有效的外源調(diào)控物，以促進(jìn)成肌細(xì)胞的移植和臨床應(yīng)用，同時(shí)為進(jìn)一步開展紅景天苷在體內(nèi)骨骼肌損傷中的作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。研究方法：研究1：紅景天苷對(duì)成肌細(xì)胞體外分化的影響：1)在C2C12中加入不同濃度紅景天苷處理，在誘導(dǎo)成肌分化過程中，應(yīng)用相差顯微鏡觀察不同濃度紅景天苷對(duì)C2C12分化過程中匯聚、融合和形成多核肌管的影響；2)應(yīng)用免疫熒光組化方法，分析不同濃度紅景天苷對(duì)C2C12成肌分化融合率的影響；3)應(yīng)用real-time PCR和Western Blotting方法，檢測(cè)紅景天苷對(duì)C2C12成肌分化特異基因和蛋白表達(dá)的影響；研究2：紅景天苷影響成肌細(xì)胞體外分化的機(jī)制初探：應(yīng)用Western Blotting方法，檢測(cè)紅景天苷處理后C2C12成肌分化中TGF-β/Smad信號(hào)通路的變化。結(jié)果：50 μg 紅景天苷處理：研究1：1)光鏡觀察結(jié)果從形態(tài)學(xué)上顯示，紅景天苷處理顯著抑制C2C12細(xì)胞的融合和多核肌管的形成；2)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明Myosin-neonatal(E-MHC)陽性面積和myogenin陽性核均顯著減少(P<0.05)，顯著抑制C2C12細(xì)胞分化過程中肌管形成，促進(jìn)細(xì)胞增殖；3)real-time PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，成肌分化特異因子MyoD和myogenin基因和蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，顯著抑制C2C12細(xì)胞分化過程中細(xì)胞的融合和肌管的形成；研究2：Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明，紅景天苷顯著抑制C2C12細(xì)胞分化效應(yīng)，伴有Smad2/Smad3磷酸化激活增加，尤其是Smad3激活水平顯著增加(P<0.01)；30 μg紅景天苷處理作用不顯著(P>0.05)。結(jié)論：1)紅景天苷能顯著抑制骨骼肌成肌細(xì)胞體外成肌分化，并促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞激活增殖，促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞庫儲(chǔ)備增加。2)紅景天苷對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞體外分化增殖的影響存在劑量依賴性，以50 μg紅景天苷干預(yù)能達(dá)到顯著效果。3)紅景天苷可能是通過促進(jìn)TGF-β/Smad通路的關(guān)鍵介導(dǎo)子Smad2和Smad3(尤其是Smad3)磷酸化來發(fā)揮作用。

紅景天苷；C2C12細(xì)胞； 成肌分化； TGF-β/Smad通路

骨骼肌損傷在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極為常見，因其愈合質(zhì)量不穩(wěn)定而成為影響運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)壽命的重要因素。骨骼肌成肌細(xì)胞，即骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，經(jīng)分裂融合為多核肌纖維，形成肌小管，最終分化為成熟的骨骼肌細(xì)胞[15]，其作為骨骼肌再生中新生肌肉的來源在骨骼肌損傷后的修復(fù)中起著非常關(guān)鍵的作用[6]。在損傷的骨骼肌中，衛(wèi)星細(xì)胞激活并通過增殖分化融合為新的骨骼肌細(xì)胞來修復(fù)受損的骨骼肌纖維。在臨床上，外源性骨骼肌成肌細(xì)胞能較好的融入體骨骼肌細(xì)胞中[16]，所以，通過成肌細(xì)胞移植來治療運(yùn)動(dòng)性損傷具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值和前景。然而，因?yàn)槌杉〖?xì)胞易于分化、難于擴(kuò)增的特點(diǎn)，很大程度上影響種子細(xì)胞批量獲取，從而阻礙成肌細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用[5,18]。因此，研究成肌細(xì)胞體外分化的調(diào)控對(duì)于骨骼肌運(yùn)動(dòng)性損傷的治療具有重要的理論與應(yīng)用意義。目前國內(nèi)、外公認(rèn)的成肌細(xì)胞體外分化調(diào)控因子主要有胰島素樣生長因子-1( IGF-1)[13]和肝細(xì)胞生長因子( HGF)[7]等，但他們主要通過促生長來實(shí)現(xiàn)對(duì)成肌細(xì)胞體外分化的抑制，而且他們公認(rèn)的成瘤作用也限制了其在臨床上的應(yīng)用[23]。因此，尋求更為有效的成肌細(xì)胞體外調(diào)控因子，仍然是該領(lǐng)域研究的一個(gè)重要課題。C2C12細(xì)胞是由C3H小鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化而來的細(xì)胞株，因?yàn)榧?xì)胞形態(tài)特性均一，可無限代培養(yǎng)，常被用作為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)育分化的研究對(duì)象。

紅景天苷是紅景天最主要的有效活性成分，其除了有利于抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強(qiáng)記憶、改善睡眠等外，還能保護(hù)心臟、抵抗輻射對(duì)人體的傷害、保護(hù)造血系統(tǒng)等，對(duì)人體亞健康的改善和某些疾病的防治具有重要作用[1,20,21]。目前，有關(guān)紅景天/紅景天苷在離體細(xì)胞培養(yǎng)中的影響，國內(nèi)外的研究主要包括紅景天/紅景天苷對(duì)脂肪細(xì)胞[19]、紅細(xì)胞[22]、淋巴細(xì)胞[17]、肝細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞[3]等影響的研究。而關(guān)于紅景天/紅景天苷對(duì)骨骼肌細(xì)胞的影響，目前國內(nèi)、外研究極少，僅有個(gè)別聚焦于對(duì)骨骼肌細(xì)胞物質(zhì)代謝方面影響的研究[12]。迄今為止，未見紅景天/紅景天苷在骨骼肌細(xì)胞增殖分化中作用及機(jī)制研究的報(bào)道。

基于以上研究背景，本研究在紅景天苷對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖分化的影響中展開研究，并提出假設(shè)：紅景天苷可能通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路來作用于成肌細(xì)胞。本研究不僅在成肌細(xì)胞增殖分化外源性干預(yù)的基礎(chǔ)研究方面有所創(chuàng)新，而且，有望為調(diào)控成肌細(xì)胞增殖分化潛能尋找到新的外源性化合物，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞的體內(nèi)移植及臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

成肌細(xì)胞株C2C12小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞，購自中國北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞庫。取一管C2C12細(xì)胞復(fù)蘇，增殖傳代到足夠細(xì)胞量后統(tǒng)一凍存。選取同代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

紅景天苷，購自中國普思生物科技有限公司，10 mg紅景天苷溶于1 ml無菌PBS配制紅景天苷工作液,即紅景天苷工作液濃度為10 μg/μl。

分組：對(duì)照組：1 ml分化液中加入5 μl不含紅景天苷的無菌PBS；30 μg紅景天苷組：1 ml分化液中加入3 μl紅景天苷工作液；50 μg紅景天苷組：1 ml分化液中加入5 μl紅景天苷溶液。

1.2 主要儀器和試劑

細(xì)胞孵育箱(Thermo)，倒置熒光顯微鏡(Leica)，電泳槽、電轉(zhuǎn)儀、電源、玻璃板等(Bio-rad)，TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(Leica)，實(shí)時(shí)定量PCR儀(Eppendorf)；DMEM、胎牛血清(Gibco)，馬血清(Hyclone)，Pax7抗體、Myf5抗體、MyoD抗體、myogenin抗體、Smad2抗體、p-Smad2抗體、Smad3抗體、p-Smad3抗體(abcam)，β-actin抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，Myosin-neonatal(E-MHC)抗體(SANTA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 成肌細(xì)胞株C2C12細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

C2C12細(xì)胞采用細(xì)胞生長液(高糖DMEM、10%FBS、青霉素 100 U/ml以及鏈霉素 100μg/ml)，于5%CO2、37℃細(xì)胞孵育箱中孵育。培養(yǎng)過程中，維持細(xì)胞密度在70%～90%的狀態(tài)，依細(xì)胞生長狀態(tài)1～2天傳代一次。

實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞以16.5×104個(gè)/皿的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長至70%～80%密度時(shí)將細(xì)胞生長液更換為細(xì)胞分化液(高糖DMEM、2%HS、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml)，誘導(dǎo)分化，每隔24 h更換分化液。每天在顯微鏡下觀察多核肌管形成。

1.3.2 免疫熒光組化方法檢測(cè)C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化后肌管融合率

細(xì)胞誘導(dǎo)分化120 h后，1 ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，1 ml/皿 1/100 PBST破膜5 h，5%的羊血清封閉1 h；5%的羊血清配制一抗E-MHC和myogenin一抗?jié)舛确謩e為1/100和1/200，過夜；5%的羊血清工作液配制二抗，山羊抗小鼠綠色二抗，二抗?jié)舛染鶠?/200，二抗2 h；配制的DAPI工作液加入細(xì)胞培養(yǎng)conforcal皿500 ml/皿，避光儲(chǔ)存于4℃。

激光共聚焦顯微鏡拍攝圖像，導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)肌細(xì)胞融合率和肌細(xì)胞融合面積。

1.3.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄及Real-Time PCR方法檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)

細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，每隔24 h收集細(xì)胞提取RNA并檢測(cè)Pax7、Myf5、Myod和myogenin基因表達(dá)，即選取分化0 h、24 h、48 h、72 h和96 h細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)。

RNA提取與反轉(zhuǎn)錄1 ml TRIzol/皿使細(xì)胞消化裂解，細(xì)胞懸液吸入2 ml EP管裂解25 min，4℃離心取上清，加入氯仿200 μl/管，劇烈振蕩搖晃15 s后靜置30 min，4℃離心后取400 ml上端無色部分，加入等體積異丙醇-20℃放置20～30 min，4℃離心留沉淀，分光光度計(jì)測(cè)濃度，根據(jù)濃度采用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA放置-20℃儲(chǔ)存待用。

Real-Time PCR 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫序列利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物：Pax7 上游5′-GGCACAAGATAGTGGAAATGG-3′，下游5′- CGACTGCGACGCTGCTTAC-3′；Myf5 上游5-CCAGCCCCACCTCCAACT-3，下游5-GACCAGACAG-GGCTGTTACATTC-3；MyoD 上游5′-TGGCAGTGAGCACTACAGC-3′，下游5′-CATCTGGCAAAAGCAGCGAAG-3′；myogenin 上游5-GACCCTACAGACGCCCACAA-3，下游5-CCGTGATGCTGTCCACGAT-3；18S 上游5′GCACACATACATGCACGAA3′，下游5′AAAATGAAAGCCCATAGC-C3′； GAPDH 上游5-TTGTGATGGGTGTGAACCACGAGA-3，下游5- CATGAGCCCTTCCACAATGCCAAA -3；以cDNA 2 μl、上游引物和下游引物各1 μl、SYBR Green酶25 μl和注射用水21 μl的反應(yīng)體系95℃預(yù)熱15 min，95℃15 s、62℃15 s、72℃20 s，50個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR，采用2-△△Ct進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.4 蛋白提取及Western Blotting 方法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

蛋白提取 細(xì)胞誘導(dǎo)分化96 h后，將細(xì)胞刮下吸入2 ml EP管，4℃離心留沉淀，加入配置好的含蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的混合液150 μl/管，混勻，置冰上裂解25 min，期間不斷吹打細(xì)胞沉淀；裂解好的蛋白液10 μl加入稀釋過濾好的蛋白定性液，在提前制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上用分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度；剩余140 μl蛋白液中加入等體積2×loading buffer，100℃加熱10 min，4℃離心取上清。提取的蛋白樣本儲(chǔ)存于-20℃待用。

Western Blotting 蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)100 V電壓電泳和60 V電壓電轉(zhuǎn)后取出NC膜，立春紅預(yù)染，5%的脫脂牛奶封閉，Pax7、Myf5、MyoD、myogenin、Smad2、p-smad2、Smad3和p-smad3封閉2 h，beta-Actin封閉過夜；5%的脫脂牛奶封閉液配制一抗，Pax7、Myf5、 Smad2、p-smad2、Smad3和p-smad3一抗?jié)舛葹?/500，MyoD和 myogenin一抗?jié)舛葹?/1 000，均為一抗過夜；beta-Actin一抗?jié)舛葹?/3 000，一抗2 h；5%的脫脂牛奶封閉液配制二抗，Pax7、myogenin和beta-Actin為鼠原一抗，采用山羊抗小鼠二抗，抗體濃度分別是1/500、1/1 000、1/3 000；Myf5、MyoD、Smad2、p-smad2、Smad3和p-smad3為兔原一抗，采用山羊抗兔二抗，抗體濃度均為1/1 000；X射線曝光膠片顯影。

顯影后的膠片掃描導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同劑量紅景天苷干預(yù)對(duì)C2C12分化中匯聚、融合和形成多核肌管的影響

采用相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化120 h對(duì)照組、30 μg紅景天苷組和50 μg紅景天苷組細(xì)胞并隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照(圖1)，觀察對(duì)照組和不同劑量紅景天苷組細(xì)胞分化狀態(tài)形態(tài)學(xué)差異(bar=100 μm)。

由圖1可見，對(duì)照組C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化120 h后有明顯粗大的肌管形成，細(xì)胞匯聚、融合狀態(tài)好。而與對(duì)照組相比，30 μg紅景天苷組細(xì)胞也有細(xì)長肌管形成，雖然肌管體積較對(duì)照組小，但仍可見細(xì)胞開始融合，有較多肌管形成，而且細(xì)胞增殖狀態(tài)不明顯；而50 μg紅景天苷組細(xì)胞成肌分化很大限度的被抑制，僅可見少量細(xì)小肌管形成，細(xì)胞匯聚融合不明顯，細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖。這從形態(tài)學(xué)上顯示了紅景天苷能抑制C2C12細(xì)胞分化并促進(jìn)增殖，且存在劑量依賴性，以50 μg紅景天苷干預(yù)時(shí)成肌抑制效果最明顯。

2.2 不同劑量紅景天苷對(duì)細(xì)胞融合率的影響

E-MHC( Myosin-neonatal )為新生肌球蛋白，是反應(yīng)細(xì)胞分化狀態(tài)及細(xì)胞融合率的標(biāo)志性指標(biāo)。

圖2、表1顯示，細(xì)胞進(jìn)行E-MHC免疫熒光染色，隨機(jī)選取3個(gè)14 mm2視野統(tǒng)計(jì)平均數(shù)，對(duì)照組E-MHC陽性肌管面積達(dá)到9.88 mm2，細(xì)胞融合率達(dá)到71%。而與對(duì)照組相比，30 μg紅景天苷組細(xì)胞E-MHC陽性肌管面積為7.98 mm2，細(xì)胞融合率依然達(dá)到58%；50 μg紅景天苷組細(xì)胞E-MHC陽性肌管面積僅2.67 mm2，細(xì)胞融合率僅19%。

myogenin為成肌調(diào)節(jié)因子家族的主要成員，是評(píng)價(jià)成肌分化狀態(tài)以及肌管形成的重要指標(biāo)。

圖1 本研究不同劑量紅景天苷在形態(tài)學(xué)上對(duì)C2C12成肌分化的影響細(xì)胞圖

圖2 本研究紅景天苷對(duì)E-MHC表達(dá)的影響細(xì)胞圖及柱狀圖

表1 本研究 E-MHC陽性面積及融合率一覽表

注：*P<0.05； **P<0.01。下同。

從圖3、表2細(xì)胞進(jìn)行myogenin免疫熒光染色可見，對(duì)照組C2C12細(xì)胞分化120 h后形成明顯粗大的肌管，myogenin陽性細(xì)胞核占視野內(nèi)總細(xì)胞核的48%，30 μg紅景天苷持續(xù)作用后，仍有肌管形成，myogenin陽性細(xì)胞核占視野內(nèi)總細(xì)胞核的35%，而50 μg紅景天苷持續(xù)作用后，僅有少量細(xì)小肌管形成，myogenin陽性細(xì)胞核僅占視野內(nèi)總細(xì)胞核的25%。

同時(shí)，由以上相差顯微鏡觀察和免疫熒光染色結(jié)果可見，紅景天苷對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞增殖分化的影響存在劑量依賴性，與30 μg紅景天苷相比，50 μg紅景天苷干預(yù)時(shí)作用更明顯。因此，后續(xù)成肌分化特異基因和蛋白檢測(cè)選取對(duì)照組和50 μg紅景天苷組進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 紅景天苷(50 μg)對(duì)成肌分化特異基因表達(dá)的影響

表3、圖4顯示，隨著分化時(shí)間的延長，Pax7基因表達(dá)水平逐漸下降，與對(duì)照組相比，紅景天苷組Pax7下降幅度更大，且在各分化時(shí)程，其表達(dá)水平均低于對(duì)照組。在分化48 h時(shí)，紅景天苷組和對(duì)照組差異最顯著，到誘導(dǎo)分化96 h時(shí)，紅景天苷組和對(duì)照組Pax7基因表達(dá)水平無顯著差異；在誘導(dǎo)分化24 h和48 h時(shí)，對(duì)照組和紅景天苷組Myf5表達(dá)無顯著差異，對(duì)照組在分化48 h時(shí)，Myf5表達(dá)出現(xiàn)峰值，而紅景天苷組Myf5的峰值出現(xiàn)在72 h，且遠(yuǎn)高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的2.5倍，至分化96 h時(shí)，紅景天苷組表達(dá)水平依然顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；隨著分化時(shí)長的增加，MyoD和myogenin表達(dá)水平都呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其中對(duì)照組MyoD表達(dá)水平峰值出現(xiàn)在分化96 h(約為0 h表達(dá)水平的6倍)，而myogenin表達(dá)水平峰值出現(xiàn)在分化72 h(約為0 h表達(dá)水平的19倍)，且到分化96 h仍然高水平表達(dá)(約為0 h表達(dá)水平的15倍)。在誘導(dǎo)分化的任何時(shí)段，紅景天苷組細(xì)胞MyoD和myogenin表達(dá)水平均低于對(duì)照組，而2組間MyoD表達(dá)水平差異在分化96 h時(shí)最顯著，myogenin表達(dá)水平差異在分化72 h時(shí)最顯著。

圖3 本研究紅景天苷對(duì)myogenin表達(dá)的影響細(xì)胞圖及柱狀圖

表2 本研究myogenin陽性核數(shù)目一覽表

表3 本研究紅景天苷干預(yù)對(duì)成肌分化不同時(shí)程相關(guān)基因表達(dá)的影響一覽表

0h24h48h72h96hConSalConSalConSalConSalPax71.00±0.040.82±0.060.47±0.02**0.35±0.060.16±0.01**0.22±0.010.23±0.01*0.21±0.030.15±0.02Myf51.00±0.0020.48±0.0010.47±0.0020.95±0.0010.82±0.0010.63±0.072.05±0.31**0.58±0.081.22±0.41**MyoD1.00±0.0311.62±0.280.88±0.422.76±0.561.62±0.12*3.15±0.172.18±0.23*6.15±0.424.13±0.11**Myogenin1.00±0.111.74±0.020.72±0.06*1.62±0.020.26±0.02**19.23±0.247.37±0.02**15.23±0.0214.22±1.04

圖4 本研究紅景天苷對(duì)成肌分化相關(guān)基因表達(dá)的影響柱狀圖

2.4 紅景天苷(50 μg)對(duì)成肌分化特異蛋白表達(dá)的影響

圖5、表4顯示，C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化96 h后，紅景天苷組細(xì)胞Pax7、MyoD和myogenin蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，而Myf5表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組，紅景天苷組Myf5表達(dá)水平約為對(duì)照組的2倍。

表4 本研究紅景天苷干預(yù)對(duì)成肌分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響一覽表

Pax7Myf5MyoDmyogeninCon1.000±0.0111.000±0.0121.000±0.0121.000±0.031Sal0.812±0.019*1.863±0.014**0.924±0.0180.951±0.035

2.5 紅景天苷處理對(duì)C2C12成肌分化中TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響

圖6、表5顯示，p-Smad3的表達(dá)水平隨著紅景天苷劑量的上升而不斷遞增，在30 μg紅景天苷干預(yù)下，其表達(dá)略有上升，但是，無顯著性差異，到50 μg紅景天苷干預(yù)后，其表達(dá)激增至對(duì)照組的2.1倍，差異非常顯著；而p-Smad2在30 μg紅景天苷作用下，表達(dá)量略低于對(duì)照組， 50 μg紅景天苷作用后，其表達(dá)增至對(duì)照組的1.4倍，差異非常顯著，但響應(yīng)強(qiáng)度不及p-Smad3。Smad2和Smad3表達(dá)量則隨劑量增加遞減，這與p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平遞增趨勢(shì)是相呼應(yīng)的。

圖5 本研究紅景天苷對(duì)成肌分化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響電泳及柱狀圖

表5 本研究不同劑量紅景天苷對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響一覽表

圖6 本研究不同劑量紅景天苷對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響電泳及柱狀圖

3 分析討論

3.1 紅景天苷對(duì)C2C12細(xì)胞體外分化的影響

本研究從形態(tài)學(xué)，細(xì)胞融合率，成肌分化特異基因和蛋白表達(dá)等幾個(gè)方面探索不同濃度紅景天苷對(duì)C2C12骨骼肌成肌細(xì)胞體外分化的影響。本研究以體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞株C2C12為研究對(duì)象，基本可以排除自體因素的干擾，更能直接說明紅景天苷對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞的影響。

在形態(tài)學(xué)上，50 μg紅景天苷能明顯抑制C2C12細(xì)胞融合、匯聚和多核肌管的形成，且在誘導(dǎo)分化過程中仍然能明顯促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞增殖。可以推斷，紅景天苷在抑制C2C12骨骼肌成肌細(xì)胞分化的同時(shí)，也能促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞增殖，增加骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞庫儲(chǔ)備。而30 μg紅景天苷對(duì)成肌細(xì)胞的分化有一定的抑制，但效果并不如50 μg紅景天苷明顯，且沒有觀察到細(xì)胞增殖的跡象。因此，也可以從形態(tài)學(xué)上推斷，紅景天苷對(duì)成肌細(xì)胞的影響存在劑量依賴性，50 μg紅景天苷效果更顯著。

E-MHC為新生肌球蛋白，是反映細(xì)胞分化狀態(tài)及細(xì)胞融合率的標(biāo)志性指標(biāo)。正常情況下，在細(xì)胞增殖期內(nèi)E-MHC表達(dá)極少，而在細(xì)胞分化過程中，隨著細(xì)胞分化時(shí)間的延長，細(xì)胞不斷融合匯聚，肌管數(shù)目增多面積增大，則E-MHC陽性表達(dá)增加，細(xì)胞融合率也上升。myogenin為成肌調(diào)節(jié)因子家族的重要成員，調(diào)節(jié)著成肌細(xì)胞進(jìn)一步終末分化為肌管肌纖維?？梢园裮yogenin作為評(píng)價(jià)成肌分化狀態(tài)以及肌管形成的重要指標(biāo)[2]。本研究中E-MHC和myogenin免疫熒光染色結(jié)果可見，50 μg紅景天苷顯著降低細(xì)胞融合率，抑制粗大肌管生成，影響成肌分化，而30 μg紅景天苷雖產(chǎn)生一定影響，但與對(duì)照組無顯著差異。此時(shí)可以確定，與30 μg紅景天苷干預(yù)相比，50 μg紅景天苷能更有效的調(diào)控骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖分化以達(dá)到本研究的目的。因此，在接下來的研究中選取50 μg紅景天苷干預(yù)濃度來進(jìn)行成肌分化特異基因和蛋白的檢測(cè)，以進(jìn)一步驗(yàn)證紅景天苷對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖分化的影響。

Pax7是在成肌細(xì)胞中表達(dá)的標(biāo)志性蛋白[11]，Myf5、MyoD和myogenin同屬于MRFs家族，是成肌細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。靜止的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞劇烈運(yùn)動(dòng)或受到創(chuàng)傷時(shí)，會(huì)大量激活Pax7，Pax7和MRFs家族相互作用，促進(jìn)肌細(xì)胞增殖和分化，Myf5是MRFs家族中最早表達(dá)的蛋白，衛(wèi)星細(xì)胞激活后，大量增殖并伴有Myf5和MyoD的表達(dá)，成肌細(xì)胞進(jìn)入分化期后，Pax7和Myf5表達(dá)大量下降并開始表達(dá)myogenin[4,9,10]。簡(jiǎn)而言之，Pax7可以看作是靜止?fàn)顟B(tài)成肌細(xì)胞增殖水平的標(biāo)志蛋白，Myf5可以看作是激活狀態(tài)成肌細(xì)胞增殖水平的標(biāo)志蛋白，MyoD和Myogenin都可以看作是激活狀態(tài)成肌細(xì)胞分化水平的標(biāo)志蛋白，但MyoD先于myogenin表達(dá)。本研究通過每隔24 h實(shí)時(shí)檢測(cè)以上4種基因在誘導(dǎo)分化成肌細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證了這一結(jié)論，即Pax7基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)分化即刻、Myf5基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)分化48 h和72 h之間、MyoD和myogenin基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在誘導(dǎo)分化96 h左右(MyoD表達(dá)隨分化時(shí)間的延長而逐漸遞增，而myogenin在誘導(dǎo)分化初期表達(dá)極少，到分化72 h后出現(xiàn)大幅迅猛增長)。紅景天苷作用后，Pax7基因和蛋白表達(dá)水平都顯著低于對(duì)照組，Myf5基因和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，可知紅景天苷不僅能有效促進(jìn)靜止態(tài)細(xì)胞的激活，且還能促進(jìn)被激活衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，從而增加衛(wèi)星細(xì)胞庫的儲(chǔ)備；在整個(gè)細(xì)胞誘導(dǎo)分化階段，紅景天苷干預(yù)后，MyoD和myogenin的基因表達(dá)水平均低于對(duì)照組，誘導(dǎo)分化96 h時(shí)，蛋白表達(dá)水平也低于對(duì)照組。

至此可以得出結(jié)論，紅景天苷能有效促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞的體外激活增殖，抑制骨骼肌成肌細(xì)胞的體外分化，從而促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞庫儲(chǔ)備的增加。本結(jié)果一方面為成肌細(xì)胞的體內(nèi)移植及臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提示，可以考慮將紅景天苷作為骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖分化的外源性調(diào)控物，來解決成肌細(xì)胞自身易分化難擴(kuò)增的問題，促進(jìn)種子細(xì)胞的批量獲取，進(jìn)而推動(dòng)成肌細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用，達(dá)到通過成肌細(xì)胞移植來治療骨骼肌損傷的目的；另一方面，為開拓紅景天苷在體內(nèi)骨骼肌損傷再生和修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提示，紅景天苷或許也可以促進(jìn)體內(nèi)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞庫的儲(chǔ)備，增加骨骼肌再生中新生肌肉的來源，從而有效幫助受損骨骼肌的體內(nèi)再生和修復(fù)，不過這需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究來佐證。

3.2 紅景天苷影響C2C12細(xì)胞體外分化機(jī)制初探

TGF-β/Smad通路是由轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor-β， TGF-β)、TGF-β受體(transforming growth factor-β receptor， TβR)以及受體底物Smad蛋白家族組成，在眾多細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中具有非常關(guān)鍵的作用。在成人骨骼肌中TGF-β/Smad通路可抑制衛(wèi)星細(xì)胞的分化、肌纖維的融合以及特定基因的表達(dá)，Smad2和Smad3是該過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[8,14]。因此，結(jié)合以上紅景天苷抑制成肌細(xì)胞分化的結(jié)論，猜想紅景天苷可能通過作用于TGF-β/Smad通路來影響成肌細(xì)胞增殖分化。所以，本研究檢測(cè)了不同濃度紅景天苷干預(yù)96 h后C2C12細(xì)胞中TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵介導(dǎo)子Smad2和Smad3的磷酸化水平。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Smad2和Smad3的磷酸化水平(尤其是Smad3)與紅景天苷劑量變化和紅景天苷成肌抑制作用均為正相關(guān)，即50 μg紅景天苷作用于誘導(dǎo)分化的骨骼肌成肌細(xì)胞時(shí)，在抑制成肌分化促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，也可以檢測(cè)到Smad2和Smad3磷酸化水平的顯著增加，且同時(shí)還檢測(cè)到Smad2和Smad3表達(dá)水平與其磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)。這說明，紅景天苷可能是通過激活Smad2和Smad3蛋白磷酸化(主要是Smad3蛋白)來發(fā)揮成肌抑制作用，而沒有增加總的Smad2和Smad3蛋白含量。不過該論斷只是初步的探索，更確定的機(jī)制研究還有待后續(xù)進(jìn)一步的研究，同時(shí)，30 μg紅景天苷對(duì)Smad2和Smad3磷酸化的作用遠(yuǎn)不如50 μg紅景天苷，與對(duì)照組無顯著差異，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究中關(guān)于紅景天苷最佳作用濃度的結(jié)論。

4 結(jié)論

1.紅景天苷能顯著抑制骨骼肌成肌細(xì)胞體外成肌分化，并促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞激活增殖，促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞庫儲(chǔ)備增加。

2.紅景天苷對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞體外分化的影響存在劑量依賴性，以50 μg紅景天苷干預(yù)能達(dá)到顯著效果。

3.紅景天苷可能是通過促進(jìn)TGF-β/Smad通路的關(guān)鍵介導(dǎo)子Smad2和Smad3(尤其是Smad3)磷酸化來發(fā)揮作用。

限于本研究條件有限，一些問題在所難免，需要更多后續(xù)研究來完善和證明：1)紅景天苷對(duì)骨骼肌成肌細(xì)胞體外增殖分化的效果是否和其濃度存在線性關(guān)系，若濃度增加到50 μg以上是否會(huì)產(chǎn)生更好的效果；2)關(guān)于TGF-β/Smad通路在紅景天苷的成肌調(diào)控中的作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effect of Different Concentrations of Salidroside on Myoblast Differentiation in Vitro and Its Preliminary Mechanism

LUO Wei1,ZHANG Peng2,AI Lei3,ZHOU Yue4,CHEN Xiao-ping2

Objective:This study is aim to explore the effect of different concentrations of salidroside on myoblast differentiation in vitro and its possible mechanism,which can help to find a more effective exogenous regulating substance for myoblast differentiation to promote the myoblast transplantation,and set the foundation for further study of the effect of salidroside on skeletal muscle in vivo.Methods:Part one:The effect of different concentrations of salidroside on myoblast differentiation in vitro:1)observe the morphology of differential myoblast C2C12 which were treated with 0,30,50 μg/ml salidroside to induce differentiation by Phase micrographs;2)Detect the cell fusion index affected by salidroside using immunofluorescence;3)Detect the expressions of myogenic differentiation-specific mRNAs and proteins affected by salidroside using Western Blotting and real time-PCR.Part two:The possible mechanism of above study :Detect TGF-β/Smad3 pathway protein expression in differential C2C12 cell treated with 0,30,50μg/ml Sal using Western Blotting. Results:Treated with 50 μg/ml salidroside:Part one:1)Salidroside inhibit C2C12 fusion and myotube form in morphological by Phase micrographs;2)Myosin-neonatal Positive area and myogenin Positive Nuclei decreased significantly by immunofluorescence(P<0.05),which inhibited myotube form notably;3)The expressions of MyoD and myogenin in mRNA and protein both decreased notably by real-time PCR and Western blotting(P<0.05),which inhibited cell fusion and myotube form during C2C12 differentiation.Part two:Salidroside inhibit C2C12 differentiation associated with increases in Smad2/Smad3 phosphorylation,especially p-Smad3(P<0.01).The results treated with 30 μg/ml salidroside is insignificant (P>0.05). Conclusion:1)Salidroside inhibit myogenic differentiation of C2C12 cell significantly,and promote cell proliferation,to add satellite cells band reserve.2)Salidroside inhibits myogenic differentiation in a dose-dependent manner,50μg/ml Salidroside is the best.3)Salidroside inhibits myogenic differentiation possibly by activating Smad2/Smad3(a key mediator in TGF-β/Smad pathway) phosphorylation.

Salidroside;C2C12cells;myogenicdifferentiation;TGF-β/Smadpathway

2015-03-24；

2015-08-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81272177)；南京體育學(xué)院科研項(xiàng)目(YJ1423)。

羅維(1989-)，女，湖北荊門人，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)生理學(xué)，E-mail：luoweihyd@163.com。

1.南京體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)健康科學(xué)系，江蘇 南京 210014；2.中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094；3.江蘇省體育科學(xué)研究所，江蘇 南京 210033；4.北京體育大學(xué)，北京 100084 1.Nanjing Sport Institute,Nanjing,210014,China;2.State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application,China Astronaut Research and Training Center,Beijing 100094,China;3.Jiangsu Research Institute of Sports Science,Nanjing 210033,China;4.Beijing Sport University,Beijing 100084,China.

1000-677X(2015)09-0050-08

10.16469/j.css.201508000

G804.5

A