楊梅，劉維，吳清華，陳翠平，王倩，裴瑾

·品種品質(zhì)·

川牛膝種子成熟度與發(fā)芽率、生活力之間關(guān)系的研究

楊梅，劉維，吳清華，陳翠平，王倩，裴瑾

目的：研究川牛膝種子成熟度與發(fā)芽率、生活力之間的關(guān)系。方法：觀察不同成熟程度川牛膝果實(shí)及種子的外觀形態(tài)，并在室溫光照條件下進(jìn)行發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)及生活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，記錄川牛膝種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及生活力。結(jié)果：不同成熟度川牛膝種子在外觀形態(tài)方面存在明顯差異，成熟的川牛膝種子的發(fā)芽率及生活力平均值分別為88.93%和94.40%，明顯高于未完全成熟的川牛膝種子。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次研究了川牛膝種子不同成熟度與發(fā)芽率、生活力之間的關(guān)系，通過(guò)探索成熟度對(duì)川牛膝種子質(zhì)量的影響，為后續(xù)保存川牛膝優(yōu)良種質(zhì)提供理論依據(jù)。

川牛膝；種子；成熟度；發(fā)芽率；生活力

川牛膝為莧科杯莧屬多年生草本植物川牛膝Cyathula offcinalis Kuan的干燥根[1]?！按ㄅＯァ敝?，最早見于唐·藺道人《仙授理傷續(xù)斷方》，為四川地方習(xí)用品，南宋時(shí)期作為懷牛膝的替代品入藥，元明以后才逐漸分化成為獨(dú)立品種。其栽培歷史可依據(jù)《本草綱目》所說(shuō)：“牛膝處處有之，謂之土牛膝，不堪服用，唯北土及川中人家栽蒔者為良”，追溯到明代[2]。別名有牛膝、天全牛膝、甜牛膝、紅毛藥等。主產(chǎn)于四川樂(lè)山、雅安，重慶奉節(jié)、巫山、巫溪，湖北恩施，湖南邵陽(yáng)等地，為著名川產(chǎn)道地藥材。具有逐瘀通經(jīng)，通利關(guān)節(jié)，利尿通淋的功效，臨床用于治療經(jīng)閉癥瘕，跌打損傷，風(fēng)濕痹痛，尿血血淋等病癥[1]。

川牛膝目前主要為人工栽培品，采用種子繁殖，并以藥農(nóng)自行留種為主。種子成熟度是影響種子質(zhì)量的重要因素之一[3]，但實(shí)際采收種子過(guò)程中，由于藥農(nóng)缺乏相關(guān)的專業(yè)知識(shí)與技術(shù)，導(dǎo)致收集的川牛膝種子成熟度存在較大差異。本文研究了川牛膝種子不同成熟度與種子發(fā)芽率及千粒重之間的關(guān)系，旨在探明不同成熟度對(duì)川牛膝種子質(zhì)量的影響，以期為后續(xù)保存川牛膝優(yōu)良種質(zhì)提供理論依

據(jù)，為川牛膝藥材的生產(chǎn)提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

川牛膝種子采自四川省樂(lè)山市金口河區(qū)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)裴瑾教授鑒定為莧科杯莧屬植物川牛膝（Cyathula officinalis Kuan）的種子。采集的川牛膝種子樣品共8批，根據(jù)果序顏色的不同分為兩類，分別編號(hào)為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5和LS1、LS2、LS3。除去果梗及殘存的花被片等雜質(zhì)，分別保存?zhèn)溆?。見圖1、圖2和圖3。

1.2 儀器與試劑

智能光照培養(yǎng)箱GTOP-260B（浙江托普儀器有限公司）；X-射線成像系統(tǒng)（Faxitron MX-20）；解剖顯微鏡（ZEISS Stereo Discovery. V12）；電子分析天平QUINTIX224-1CN(北京Sartorius天平有限公司）；培養(yǎng)皿；濾紙；Na2HPO4；KH2PO4；紅四氮唑（TTC）等。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 果序的顏色比較

因川牛膝種子樣品采集時(shí)，正值川牛膝主產(chǎn)區(qū)采挖藥材。采用肉眼觀察果序的顏色，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，此期間川牛膝果序的顏色存在差異，大部分川牛膝（編號(hào)為HS）在采挖時(shí)果序的顏色為黃色，部分川牛膝（編號(hào)為L(zhǎng)S）在采挖時(shí)果序的顏色為黃綠色。見圖1和圖2。

圖2 編號(hào)為L(zhǎng)S的果序

圖1 編號(hào)為HS的果序

2.2 不同批次種子形態(tài)觀察

采用肉眼和體式顯微鏡觀察果實(shí)、種子外觀形態(tài)，通過(guò)用X-Ray成像系統(tǒng)透射成像，觀察HS和LS川牛膝的種子形態(tài)特征。川牛膝果實(shí)為胞果，橢圓形或倒卵形，淡黃色，包裹在宿存花被內(nèi)，長(zhǎng)5.0～6.2mm，寬1.8～2.2mm?；ㄖL(zhǎng)約1.5mm，宿存（圖5）。種子1粒，橢圓形，透鏡狀，帶紅色，光亮，長(zhǎng)1.9～2.4mm，寬1.2～1.7mm（圖3）。采用X射線成像系統(tǒng)觀察，LS川牛膝的種子在X光透射成像后，可以觀察到未發(fā)育完全的干癟種子形態(tài)，見圖5和圖6。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：編號(hào)為HS的川牛膝果實(shí)為黃褐色，種子為棕色，帶紅光；編號(hào)為L(zhǎng)S的川牛膝果實(shí)為黃色或黃綠色，種子為黃棕色，帶紅光。由圖3和圖4可知，HS川牛膝果實(shí)和種子的顏色均比LS川牛膝的果實(shí)和種子的顏色深。同時(shí)，由圖5和圖6可知，HS川牛膝種子更加飽滿，發(fā)育更完全。

圖3 不同顏色果序的川牛膝果實(shí)照片

圖4 不同顏色果序的川牛膝種子照片

圖5 HS種子X(jué)-Ray成像

圖6 LS種子X(jué)-Ray成像

圖7 體式顯微鏡觀察川牛膝種子形態(tài)，放大倍數(shù)為2倍

2.3 種子物理指標(biāo)的測(cè)定

2.3.1 種子千粒重的測(cè)定 千粒重表示的是1000粒種子的重量，它是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的一項(xiàng)指標(biāo)，千粒重越重，飽滿種子占供試樣品質(zhì)量的百分率越高，種子品質(zhì)越好。選擇千粒法[4]測(cè)定，將樣品充分混合，從中隨機(jī)取3份，每份1000粒，稱重，精確到0.001g，取其平均值，即種子的千粒重。研究結(jié)

果見表1。

2.3.2 種子含水量的測(cè)定 參照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB /T 3543.6種子水分測(cè)定方法，對(duì)種子的含水量進(jìn)行測(cè)定。

先將稱量瓶預(yù)先烘干、冷卻、稱重，稱取川牛膝種子5g放入預(yù)先烘干和稱重過(guò)的稱量瓶?jī)?nèi)，再稱重(精確至0.001g)，每個(gè)樣本做兩次重復(fù)。使供箱通電預(yù)熱至110～115℃，將樣品攤平放入烘箱內(nèi)的上層，使箱溫在5～10min內(nèi)回至103±2℃時(shí)開始計(jì)時(shí)，烘8h，取出移入干燥器內(nèi)冷卻至室溫再稱重。研究結(jié)果見表1。

表1 HS和LS川牛膝種子千粒重及含水量比較

結(jié)果：HS和LS川牛膝種子的千粒重差異顯著，HS川牛膝種子的千粒重平均值為2.354g，LS川牛膝種子的千粒重平均值為1.388g，由此可知，HS川牛膝千粒重明顯高于LS川牛膝種子。同時(shí)由表1可知，HS和LS川牛膝種子的含水量存在差異，HS川牛膝種子的含水量平均值為13.65%，而LS川牛膝種子的含水量平均值為12.41%。

2.4 發(fā)芽試驗(yàn)

參考張祎楠[5]的方法。設(shè)定發(fā)芽床為濾紙；發(fā)芽溫度定為25℃；培養(yǎng)皿水分為70%；光照條件為8h光照，16h黑暗。首次計(jì)數(shù)時(shí)間為第2天；末次計(jì)數(shù)時(shí)間：第10天。每份材料重復(fù)3次，每次重復(fù)隨機(jī)取100粒種子進(jìn)行發(fā)芽，胚軸長(zhǎng)度達(dá)到真種子自身長(zhǎng)度時(shí)計(jì)為發(fā)芽。

發(fā)芽率以最終種子發(fā)芽數(shù)占供試種子數(shù)的百分比計(jì)。發(fā)芽勢(shì)是指種子發(fā)芽初期，它在規(guī)定時(shí)間內(nèi)能正常發(fā)芽的種子粒數(shù)占供試種子粒數(shù)的百分率。本實(shí)驗(yàn)以第7d作為計(jì)算發(fā)芽勢(shì)的時(shí)間。發(fā)芽指數(shù)：發(fā)芽指數(shù)GI=∑（Gt/Dt ）（Gt為在t天的種子發(fā)芽數(shù)，Dt為相對(duì)應(yīng)的種子發(fā)芽天數(shù)）。結(jié)果見表2。

2.5 生活力測(cè)定

四唑?yàn)榘咨勰?，水溶液無(wú)色，在種子組織活細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的作用下，無(wú)色的氯化三苯基四氮唑接收活種子代謝過(guò)程中呼吸鏈上的氫，在活細(xì)胞里變成還原態(tài)的紅色、穩(wěn)定、不擴(kuò)散的三苯基甲臘。根據(jù)四唑染色的顏色和部位，區(qū)分種子紅色的有生活力部分和無(wú)色的死亡部分。

參照張祎楠[5]的方法，采用0.5%的紅四氮唑（TTC）測(cè)定川牛膝種子的生活力。將川牛膝種子剝出，并用蒸餾水在25℃恒溫條件下浸泡24h，用刀片將種子縱剖為兩半，將其置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿50個(gè)半粒，加入0.5%的TTC溶液，讓TTC溶液剛好覆蓋種子，然后將其置于28℃恒溫箱中染色5h。另一半川牛膝種子置于沸水中，使其胚失去活性，使用同樣的方法染色，以此作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 HS和LS川牛膝種子的發(fā)芽情況及生活力比較

結(jié)果：HS和LS川牛膝種子的發(fā)芽能力及生活力存在顯著差異。HS川牛膝種子的發(fā)芽能力及生活力明顯高于LS川牛膝種子。

3 結(jié)論與討論

3.1 通過(guò)對(duì)HS和LS川牛膝種子從果序顏色、果實(shí)與種子外觀形態(tài)比較、千粒重與含水量的比較及發(fā)芽試驗(yàn)等方面的研究比較發(fā)現(xiàn)，HS和LS川牛膝的種子在外部形態(tài)特征上存在一定差異，HS川牛膝種皮的顏色比LS川牛膝種皮的顏色深，HS川牛膝種子中干癟種子的比例比LS川牛膝種子低。所以可以確定編號(hào)為L(zhǎng)S的川牛膝種子未完全成熟。

3.2 HS川牛膝種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及生活力均比LS川牛膝種子高。說(shuō)明川牛膝種子的成熟度是影響種子質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。所以在川牛膝種子生產(chǎn)過(guò)程中，適時(shí)采收是提高種子質(zhì)量的重要措施之一。

3.3 種子生活力通常是指一批種子中具有生命力（即活的）種子數(shù)占種子總數(shù)的百分率。一般情況下，高活力的種子在適宜條件下一定能發(fā)芽，而且發(fā)芽快，出苗整齊的種子也一定有高的生活力；能發(fā)芽的種子都是具有生活力的種子，但是有生活力的種子不一定能發(fā)芽。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，LS川牛膝的種子（未完全成熟）的生活力平均值達(dá)78.00%，其發(fā)芽率平均值才20.66%。導(dǎo)致此結(jié)果的原因?yàn)榉N子在發(fā)育過(guò)程中已經(jīng)形成了胚，并且其胚組織具有活性，由于未發(fā)育成熟而不具備發(fā)芽能力，所以出現(xiàn)了高生活力低發(fā)芽率的情況。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010年版一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:35.

[2] 彭成.中華道地藥材[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2011:2810.

[3] 范巧佳,方志然,孫磊,等.川牛膝種子發(fā)芽特性的研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,31(3):254.

[4] 國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì).顏啟傳,畢辛華(譯).國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程[S].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1985.

[5] 張祎楠.川牛膝種質(zhì)資源評(píng)價(jià)研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文,2013.

（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Study on the connection among the maturity,the germination rate and the viability of Cyathula officinalis Kuan seed

YANG Mei, LIU Wei, WU Qing-hua, CHEN Cui-ping, WANG Qian, PEI Jin//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; Key laboratory of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources in Sichuan Province—Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To study the connection among the maturity, the germination rate and the viability of Cyathula officinalis Kuan seed.Method:The appearance shape of different maturity Cyathula officinalis Kuan fruit and seeds were observed. The germination and viability measurement experiments were carried out at room temperature and under light. The maturity, germination rate and the viability of Cyathula officinalis Kuan seed were recorded.Result:Obvious difference was found in appearance of the different maturity Cyathula offcinalis Kuan seeds. The average germination rate and viability of mature seed were 88.93% and 94.40% respectively which were signifcantly higher than that of the immature seeds.Conclusion:The connection among the maturity, the germination rate and the viability of Cyathula offcinalis Kuan seed are investigated for the frst time by exploring the infuence of maturity on the quality of Cyathula offcinalis Kuan seed, as to provide theoretical basis for preserving Cyathula offcinalis excellent germplasm.

Cyathula offcinalis Kuan; seed; maturity; germination rate; viability

R 282

A

1674-926X(2015)02-001-03

四川省科技廳科技項(xiàng)目（2014SZ0156）

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

楊梅(1989-)，女，碩士生，從事中藥品種、質(zhì)量及資源研究

Tel:15882425997 Email:731816886@qq.com

裴瑾(1970-)，女，教授，從事中藥品種、質(zhì)量及資源研究

Tel:(028)61800231 Email:peixjin@163.com

2015-02-06