張凱麗,鄭晗青,牛啟啟，鄧曉敏,楊雪蓮,2,*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

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釀酒酵母工程菌分批發(fā)酵產(chǎn)UMP動(dòng)力學(xué)模型

張凱麗1,鄭晗青1,牛啟啟1，鄧曉敏1,楊雪蓮1,2,*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

對釀酒酵母工程菌產(chǎn)UMP的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。通過對Logistic方程、Leudeking-Piret方程和類Luedeking-Piret方程進(jìn)行參數(shù)估計(jì)和非線性數(shù)據(jù)擬合,分別得到發(fā)酵過程中菌體干重、UMP產(chǎn)量、殘?zhí)呛縿?dòng)力學(xué)模型及模型參數(shù)。對擬合曲線進(jìn)行分析,結(jié)果表明模型值與實(shí)驗(yàn)值擬合性良好,線性擬合度大于98%,所建立模型能較好的反映UMP的分批發(fā)酵過程。

尿嘧啶核苷酸,線性擬合,動(dòng)力學(xué)

尿嘧啶核苷酸(Uridine 5′-monophosphate,UMP)是一種重要的食品添加劑和藥物中間體,是嘧啶核苷酸生物合成中處于節(jié)點(diǎn)位置的核苷酸[1],廣泛應(yīng)用于寡聚糖合成和抗癌藥物生產(chǎn)中,市場需求很大,蘊(yùn)含有良好的商業(yè)潛力[2-3]。目前,利用微生物轉(zhuǎn)化乳清酸生成UMP逐漸成為研究的熱點(diǎn),因其目的產(chǎn)物明確、反應(yīng)體系簡單,成為未來工業(yè)化生產(chǎn)核苷酸的理想途徑。已有報(bào)道的用于生物轉(zhuǎn)化的菌株主要為產(chǎn)氨短桿菌[4-8]。錢秀萍[6]等用離子束誘變產(chǎn)氨短桿菌R248后尿苷酸產(chǎn)量約為900mg/L。Wang Xing[7]等對產(chǎn)氨短桿菌ATCC 6872催化合成UMP進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,UMP產(chǎn)量達(dá)38.5mmol/L。Tatsuro Fujio[8]等人將產(chǎn)氨短桿菌KY13505的細(xì)胞經(jīng)表面活性劑處理后UMP可達(dá)28.6g/L。部分學(xué)者對釀酒酵母產(chǎn)UMP也進(jìn)行了研究,雷高新[9]等利用全細(xì)胞催化法發(fā)酵釀酒酵母,其UMP產(chǎn)量為7mmol/L?？紤]到釀酒酵母具備良好的基因操作背景、生物兼容性及安全性,采用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的能夠過量表達(dá)UMP從頭合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶——乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(OPRTase)和乳清苷酸脫羧酶(ODCase)的釀酒酵母工程菌BJX12-URA5,進(jìn)行UMP分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究,確定微生物生長速率、發(fā)酵產(chǎn)物合成速率、底物消耗速率之間的動(dòng)態(tài)定量關(guān)系,建立相應(yīng)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型,為菌種高產(chǎn)UMP提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母工程菌BJX12-URA5由實(shí)驗(yàn)室保藏；UMP為色譜純 上?？迫鹕锕?；種子培養(yǎng)基 酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖40g/L、酵母粉 2g/L、蛋白胨4g/L、乳清酸1g/L、NaH2PO44g/L、MgSO41g/L、甲苯0.2%,葡萄糖單獨(dú)滅菌,121℃滅菌20min。

Waters2695型四元高效液相色譜儀、SunFireTMC18(5μm,4.6×150mm)色譜柱 美國Waters公司；CR-22G離心機(jī) 日本日立公司；GBJT三聯(lián)體發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 將-80℃冰箱中凍存的含30%甘油的BJX12-URA5活化后,轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中,30℃、200r/min培養(yǎng)24h。

1.2.2 分批發(fā)酵培養(yǎng) 在2.5L發(fā)酵罐中加入1L新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量10%、發(fā)酵溫度30℃、通氣量1L·h-1、攪拌轉(zhuǎn)速300r/min,流加NaOH以控制pH維持在5.0。發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后下罐。發(fā)酵液10000r/min離心20min,分別收集菌體及發(fā)酵上清液,菌體用于干重檢測,上清液于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌體干重檢測 將2mL發(fā)酵液離心所得菌體于60℃烘箱中烘干12h,稱量其干重。

1.2.4 發(fā)酵液中殘?zhí)呛康臏y定 按照DNS法測定殘?zhí)呛縖10]。

1.2.5 HPLC法測定UMP含量 色譜柱為SepaxHP-C18(4.6×250 mm),流動(dòng)相為磷酸∶水=3∶500(三乙胺調(diào)pH為6.6),流速為0.8mL/min,用紫外檢測器在261nm波長下檢測。按照外標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵液中UMP含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 BJX12-URA5分批發(fā)酵產(chǎn)UMP的發(fā)酵過程

分批發(fā)酵進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),其菌體干重、殘?zhí)呛?、UMP產(chǎn)量隨時(shí)間的變化曲線如圖1所示。由圖可知,0～40h,菌體干重逐漸增大,葡萄糖大量消耗,UMP產(chǎn)量逐漸升高。繼而進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體干重基本恒定,殘?zhí)呛肯乃俾蕼p慢,UMP產(chǎn)量得到快速積累。由于UMP是組成酵母RNA的一種核苷酸,關(guān)系到遺傳信息的傳遞和蛋白質(zhì)合成等生理功能,對數(shù)期酵母大量生長繁殖時(shí),UMP大部分被利用；穩(wěn)定期代謝產(chǎn)物開始積累,由于過表達(dá)OPRTase和ODCase,使UMP得以積累。因此,UMP產(chǎn)量的積累和菌體生長的關(guān)系為部分生長相關(guān)型[9]。

圖1 釀酒酵母分批發(fā)酵曲線Fig.1 Batch fermentation process of Saccharomyces cerevisiae

2.2 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

2.2.1 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型 如圖1所示,BJX12-URA5的生長曲線接近于S型曲線,Logistic模型也是一個(gè)典型的S型曲線,采用Logistic方程能較好的描述菌體的生長規(guī)律,同時(shí)反映分批發(fā)酵過程中菌體濃度的增大對菌體自身的抑制作用[11-13]。

Logistic 生長模型方程為:

式(1)

式中:x為菌體濃度(g/L)；xm為最大菌體濃度(g/L)；μm為最大比生長速率(h-1)；t為發(fā)酵時(shí)間。

當(dāng)t=0時(shí),x=x0,x0為初始菌體濃度,對式(1)積分得:

式(2)

2.2.2 UMP生成動(dòng)力學(xué)模型 Leudekin-Piret方程[14]既能反映伴隨菌體細(xì)胞生長的產(chǎn)物生成速率,又能反映出獨(dú)立于菌體細(xì)胞生長之外,細(xì)胞催化底物形成產(chǎn)物的速率[15-16]。Luedekin-Piret方程如下:

式(3)

式中:α,β為模型參數(shù)。

根據(jù)代謝產(chǎn)物生成和菌體生長的關(guān)系,產(chǎn)物生成分為偶聯(lián)型、非偶聯(lián)型和部分偶聯(lián)型三類。當(dāng)α≠0、β=0時(shí),產(chǎn)物生成與細(xì)胞生長為生長偶聯(lián)型；α=0、β≠0,為非生長偶聯(lián)型；α≠0、β≠0為部分生長偶聯(lián)型[13,15,17-18]。通過對圖1分析可知,菌體生長階段有少量UMP生成,大部分則是在菌體生長穩(wěn)定期生成,所以,UMP的生成與菌體生長為部分生長偶聯(lián)型[11]。所以α≠0、β≠0,將式(1)帶入式(3)可得

式(4)

對式(4)積分得

式(5)

2.2.3 葡萄糖消耗動(dòng)力學(xué)模型 根據(jù)物料平衡原理,UMP分批發(fā)酵過程中,葡萄糖作為碳源和能源物質(zhì)用于菌體細(xì)胞生長,維持菌體新陳代謝以及合成代謝產(chǎn)物[12-13]。底物消耗動(dòng)力學(xué)可采用類Luedekin-Piret方程:

式(6)

式中:s為基質(zhì)濃度(g/L)；p為產(chǎn)物濃度(g/L)；m為細(xì)胞的維持系數(shù)(s-1)；Yx/s為菌體對底物的得率常數(shù)；Yp/s為產(chǎn)物積累得率常數(shù)。

表1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table1 Parameter values in kinetic models of fermentation

微生物發(fā)酵過程中,維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)需要消耗的底物所占的比例相對較少,大部分底物用于代謝產(chǎn)物的積累,因而可以被忽略[18-19],即m=0。

式(7)

將式(7)積分得:

式(8)

2.3 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型求解

上述發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型中包含了8個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù),運(yùn)用Origin 8軟件進(jìn)行自定義函數(shù)非線性擬合,根據(jù)發(fā)酵數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻(xiàn)獲得參數(shù)的初估值,最終擬合得到誤差平方和最小的參數(shù)值[12],見表1所示。

據(jù)表1的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)得BJX12-URA5發(fā)酵產(chǎn)UMP動(dòng)力學(xué)模型:

2.4 擬合曲線分析

根據(jù)動(dòng)力學(xué)模型,應(yīng)用Origin 8軟件得到UMP分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線,并繪制95%置信區(qū)間和95%預(yù)測區(qū)間,結(jié)果如圖2～圖4所示。菌體干重、UMP產(chǎn)量以及殘?zhí)呛康膶?shí)測值和預(yù)測值比較如表2所示。

圖2 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線(X-t)Fig.2 Cell growth kinetics model fitting curve

圖3 殘?zhí)窍膭?dòng)力學(xué)模型擬合曲線(S-t)Fig.3 Glucose consumption kinetic model fitting curve

圖4 UMP生成動(dòng)力學(xué)模型擬合曲線(P-t)Fig.4 UMP generate kinetic model fitting curve

菌體生長、殘?zhí)呛亢蚒MP產(chǎn)量3條曲線擬合度R2分別為0.9844、0.9923、0.9942。結(jié)合擬合曲線可知方程擬合程度較好,并且圖中所有的實(shí)驗(yàn)測定值均在95%預(yù)測區(qū)間內(nèi),大部分值處于95%置信區(qū)間內(nèi),說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高,該動(dòng)力學(xué)模型基本可以反映UMP分批發(fā)酵的過程。由表2可知,菌體干重在5h前相對誤差δ較大,大于20%,13h后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合較好。原因可能是菌體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后進(jìn)入遲滯期,遲滯期生物量較小,容易產(chǎn)生測量誤差[20-22]。發(fā)酵前期,殘?zhí)呛喀妮^小,88h后由于次級代謝產(chǎn)物積累,殘?zhí)呛拷档?測量誤差增大,δ值較大。UMP產(chǎn)量在發(fā)酵29h內(nèi)δ均高于20%,這與UMP初期合成量過少,容易產(chǎn)生測量誤差有關(guān)。30h后δ較小,擬合良好?？傮w來看,分批發(fā)酵過程中三條曲線均擬合良好,可以較好地反映酵母的生長規(guī)律、葡萄糖的消耗規(guī)律以及UMP的生成規(guī)律。

表2 菌體干重、殘?zhí)呛?、UMP產(chǎn)量的實(shí)測值與預(yù)測值的比較Table2 Comparison between experimental and predicted values of dry cell weight,residual sugar content,UMP content

3 結(jié)論

綜上,應(yīng)用Origin 8軟件對釀酒酵母工程菌BJX12-URA5發(fā)酵過程中菌體干重、UMP產(chǎn)量、殘?zhí)呛縿?dòng)力學(xué)進(jìn)行自定義函數(shù)非線性擬合,得到相應(yīng)的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型及參數(shù)；通過對擬合曲線進(jìn)行分析表明模型預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值擬合度良好,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高,說明該動(dòng)力學(xué)模型基本能合理的反映BJX12-URA5產(chǎn)UMP的發(fā)酵過程,為UMP的發(fā)酵生產(chǎn)控制提供了理論依據(jù)。由于釀酒酵母發(fā)酵原料、菌株及發(fā)酵過程的復(fù)雜性,還有很多的工作需要深入地探討,UMP發(fā)酵的模型也需要不斷地建立與完善。

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Kinetic models for uridine 5′-monophosphate batch fermentation bySaccharomycescerevisiae

ZHANG Kai-li1,ZHENG Han-qing1,NIU Qi-qi1,DENG Xiao-min1,YANG Xue-lian1,2,*

(1.School of Food Science and Technology,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China；2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China)

The dynamic models for uridine 5′-monophosphate batch fermentation bySaccharomycescerevisiaerecombinant strain was studied. The kinetic models for dry cell weight,the content of uridine 5′-monophosphate and residual sugar were proposed with the Logistic equation,Leudeking-Piret equation and class Luedeking-Piret equation though the parameters estimation and nonlinear least-squares fitting method.The results showed that the experimental values and the fitted values fit well by analyze fitted curve,the fit of the linear over 98%.The models can reflect the batch fermentation of uridine 5′-monophosphate well.

uridine 5′-monophosphate;linear fit;kinetics

2014-07-14

張凱麗(1990-),女,碩士研究生,主要從事食品與微生物發(fā)酵工程。

*通訊作者:楊雪蓮(1980-),女,博士,講師,主要從事食品生物技術(shù)研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301410)；科研基地建設(shè)—科技創(chuàng)新平臺(tái)—國家自科基金配套(北京市級,19005418040)；北京市級大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃(SJ201402065)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0158-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.026