李進偉,蔡文辭,劉元法

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

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煎炸油中總極性物質對細胞抑制和誘導凋亡的影響

李進偉,蔡文辭,劉元法

(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

研究煎炸油中總極性物質(TPM)對細胞的生長抑制和誘導凋亡。結果表明:1.0mg/mL的TPM作用于HepG2細胞24、48、72h后,細胞增殖抑制率分別為9.8%、12.6%、16.1%;流式細胞儀結果顯示,隨著TPM濃度的增加,加藥組細胞凋亡率逐漸增加,G0/G1期細胞數(shù)目逐漸減少,S期細胞數(shù)目逐漸增多,說明TPM對HePG2細胞增殖的抑制發(fā)生在S期。

煎炸油,總極性物質,HepG2細胞,細胞凋亡

煎炸油在加熱煎炸油的過程中,由于高溫、水分、空氣(氧氣)的存在,油脂分子發(fā)生許多復雜的氧化、水解、聚合反應,生成一些比正常的甘油三酯極性大的物質,即為煎炸油中的極性物質(TPM)。煎炸油中極性物質的增加會對人體健康產生不利影響,因此,越來越多的國家限制煎炸油中極性物質的含量,歐洲國家規(guī)定其含量不能超過25%[1]。國內對極性物質對人體健康研究相對較少,研究主要針對煎炸油本身的變化和煎炸油對人體的影響[2-5]。HepG2細胞在物質對人體肝細胞毒性實驗體系中常被使用,因為HepG2細胞分化程度相對較高,與正常人體肝細胞在各方面都十分接近,有許多相同的功能與特點,生物轉化代謝Ⅰ相和Ⅱ相酶都被較完整的保留,且較容易傳代[6-7]。因此,本文通過研究煎炸油中極性物質對HepG2細胞抑制和和誘導凋亡影響,為進一步探索極性物質對人類健康的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煎炸專用油 上海益海嘉里有限公司;柱層析硅膠 青島海洋有限公司;HepG2細胞 江南大學醫(yī)藥學院提供;噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司;Hoechst 33258染色試劑盒、胰酶細胞消化液、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒 碧云天生物技術研究所;胎牛血清、RPM1640培養(yǎng)基 美國Gibco公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱 無錫熱電公司;M5酶標儀 美國Molecular Devices公司;倒置生物顯微鏡、FACS Calibur流式細胞儀 美國Becton Dickson公司;LSCM激光共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 極性物質的制備 將煎炸油放入煎炸容器中,(180±5)℃下加熱40h,取出,冷卻,利用傳統(tǒng)硅膠柱層析法分離得到煎炸油中的極性成分[8],將其置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 TPM對HepG2細胞周期的影響Table1 Effect of TPM on HepG2 cells cycle

1.2.2 細胞的培養(yǎng) HePG2細胞用含10%胎牛血清的RPM 1640培養(yǎng)液在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

1.2.3 TPM對HepG2細胞的生長抑制實驗 將對數(shù)期生長的HepG2細胞,加入0.25%的胰酶消化液將細胞消化,吹打分散并以細胞計數(shù)器計數(shù)。設置五個濃度,分別為0.05、0.25、0.50、1.00、2.00mg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。對照組為100μL RPM1640培養(yǎng)液。然后按MTT標準方法處理細胞,用酶標儀在570nm波長下測定其吸光(OD)值。

1.2.4 Hoechst 33258染色法檢測細胞形態(tài)變化實驗 本實驗極性物質濃度為0.05、0.50、2.00mg/mL,每個濃度設置三個重復。根據(jù)細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒中步驟處理細胞,處理好樣品之后,用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài),放大倍數(shù)為40倍。

1.2.5 TPM對HepG2細胞周期和凋亡的影響實驗 本實驗極性物質濃度為0.05、0.50、2.00mg/mL,每個濃度設置三個重復。根據(jù)細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒中步驟處理細胞,用流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡情況[9]。

2 結果和討論

2.1 TPM對HepG2細胞的生長抑制評價

MTT法檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度TPM對HepG2細胞均有抑制作用,從圖1可以看出:經(jīng)不同濃度的TPM作用HepG2細胞24h后,隨著TPM藥物濃度的增加,細胞增殖抑制率也逐漸增大,TPM對HepG2細胞生長抑制影響呈劑量依賴性。用質量濃度相同的TPM作用HepG2細胞(24、48、72h)后對其細胞增殖抑制率進行比較,隨著作用時間的延長,細胞增殖的抑制率也逐漸增長,1.0mg/mL的TPM作用HepG2細胞24、48、72h后,細胞增殖抑制率分別為9.8%、12.6%、16.1%,在相同濃度下,TPM對HepG2細胞生長抑制呈時間依賴性。這與一些學者研究結果相似,齊芳華發(fā)現(xiàn)華蟾素對HepG2細胞生長抑制影響呈劑量依賴性和時間依賴性[10];Liu發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素對HepG2細胞生長抑制影響呈劑量依賴性和時間依賴性[7]。

圖1 不同濃度 TMP對HePG2細胞生長的抑制曲線Fig.1 The HePG2 cells growth inhibition curves by different concentrations TMP

2.2 TPM對HepG2細胞形態(tài)的影響

細胞形態(tài)學觀察是判斷細胞凋亡的一個典型的指標和基本參數(shù),通過觀察細胞的這些變化可以判斷出細胞是否發(fā)生凋亡。未經(jīng)TPM處理的細胞染色后在激光共聚焦顯微鏡下呈現(xiàn)正常的藍色,且細胞大小均一,細胞核質均勻,細胞核呈現(xiàn)均勻的藍色熒光;經(jīng)不同濃度的TPM處理48h后,用Hoechst 33258熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察,可見細胞形態(tài)發(fā)生變化,低劑量組的細胞形狀變大,中劑量組可見細胞核皺縮且部分細胞核碎裂,高劑量組可見細胞核呈現(xiàn)濃染,核質皺縮。

圖2 TPM對HepG2細胞凋亡的影響(Hoechst 33258熒光染色,×40)Fig.2 Effect of TPM on HepG2cells apoptosis (Hoechst 33258 staining,×40)

2.3 TPM對HepG2細胞周期的影響

經(jīng)不同TPM處理的HepG2細胞,流式細胞儀分析細胞周期結果見表1。與空白對照組比較,細胞隨著TPM濃度的增加,G0/G1期細胞數(shù)目逐漸減少,S期細胞數(shù)目逐漸增多,并且隨著藥物濃度和作用時間的增加,這種現(xiàn)象更加明顯,說明煎炸油中TPM對HePG2細胞增殖的抑制發(fā)生在S期,且具有濃度依賴性。

2.4 TPM對HepG2細胞凋亡的影響

TPM對HepG2細胞凋亡的影響見表2,由表2可知,TPM作用HepG2細胞24h后,濃度從0.05mg/mL增大到2.00mg/mL時,細胞的凋亡率由0.78%增加到4.82%;TPM作用HepG2細胞48h后,濃度從0.05mg/mL增大到2.00mg/mL時,凋亡率由1.25%增加到5.99%;當TPM濃度相同時,隨著TPM處理HepG2細胞時間的增加,細胞的凋亡率也不斷增加。隨著TPM濃度的增加及作用時間的延長,活細胞比例逐漸減少,發(fā)生凋亡和壞死的HepG2細胞數(shù)目逐漸增加,這表明TPM具有誘導HepG2細胞凋亡的作用。這與一些學者研究結果相似,Bonsi和Renzulli等研究表明在培養(yǎng)細胞中加入一定濃度黃曲霉毒素對HepG2細胞有很強的毒性,細胞凋亡大幅度增加[10-11]。

表2 TPM對HepG2細胞凋亡的影響Table2 Effect of TPM on HepG2 cells apoptosis

3 結論

煎炸油中TPM對HepG2細胞生長抑制影響呈劑量依賴性,在相同濃度下,TPM對HepG2細胞生長抑制呈時間依賴性。

煎炸油中煎炸油中TPM對HePG2細胞增殖的抑制發(fā)生在S期,且具有濃度依賴性。TPM具有誘導細胞凋亡的作用。

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Effect of the total polar components of frying oil on inhibition and induction of cell

LI Jin-wei,CAI Wen-ci,LIU Yuan-fa

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The total polar components(TPM)of frying oil was investigated for its inhibition rate and induction of apoptosis of cell line HepG2. After treated with TPM of 1.0mg/mL for 24,48,72h,the inhibition rate of HepG2 cells were 9.8%,12.6%,16.1%,respectively. In the same time,with the increase of drug concentration,cell apoptosis rate increased. TMP could reduce the cell population in G0/G1phase and increase the cell population in S phase,which indicated that the inhibition of cell proliferation with TPM treatment may be occurred in S phase.

frying oil;total polar components;HepG2 cell;cell apoptosis

2014-08-07

李進偉(1972-)，男，博士，副教授，主要從事脂質科學方面研究。

“十二五”國家科技計劃課題(2011AA100806-3)；國家自然基金(31171703)；江蘇省產學研創(chuàng)新項目(BY20120460)。

TS201.4

A

:1002-0306(2015)09-0358-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.070