王 曉,鄭鈞予,彭曉龍,喬雅斐,周 方,趙麗麗,張柏林

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

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乳桿菌脫除伏馬毒素的研究

王 曉1,鄭鈞予1,彭曉龍1,喬雅斐2,周 方1,趙麗麗1,張柏林1

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京 100083;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

為了探究植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)B7和戊糖乳桿菌(L.pentosus)X8對伏馬毒素FB1和FB2脫除作用及影響因素。本文采用高效液相熒光檢測的方法研究菌體細(xì)胞的伏馬毒素脫除率。結(jié)果表明植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8在37℃吸附1h后對FB1的脫除率分別為52.9%和58.0%,對FB2的脫除率分別達(dá)到了85.2%和86.5%。pH、溫度、酶影響菌株B7和X8結(jié)合伏馬毒素FB1和FB2的效果,并且兩株菌脫除伏馬毒素的作用與其活力無關(guān)。兩株菌體結(jié)合伏馬毒素的效率隨pH升高而降低。當(dāng)pH>7時,無法檢測到兩株乳桿菌具有結(jié)合伏馬毒素的能力。經(jīng)100℃沸水浴處理后,菌體細(xì)胞脫除伏馬毒素的效率上升;經(jīng)溶菌酶處理后,菌體脫除伏馬毒素的效率降低。兩株乳桿菌具有以吸附方式脫除伏馬毒素FB1和FB2的能力,但吸附FB2的效果高于吸附FB1的效果。

乳桿菌,伏馬毒素,影響因素,脫除作用

乳桿菌在益生性和脫除致癌因子方面的作用,已經(jīng)得到了學(xué)者的廣泛關(guān)注和認(rèn)可。漆葉瓊等[1]篩選出14株乳桿菌與致癌物苯并芘共同培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)所選用的乳桿菌能夠吸附苯并芘而不能將其降解或轉(zhuǎn)化。其中,植物乳桿菌121和戊糖乳桿菌ML32對致癌物苯并芘的吸附率分別達(dá)到了65.9%和64.9%。Niderkorn等[2]選用202株菌株對加標(biāo)有玉米赤霉烯酮(ZEN)、DON、FB1和FB2玉米漿的脫毒研究證實(shí),大多數(shù)菌體能夠有效地降低玉米漿中真菌毒素的含量,其中有8株乳桿菌能夠?qū)EN降解為α-ZEN。韓鵬飛等[3]報道指出,微生物之所以能夠吸附真菌毒素與其復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān),它們在不同作用力的作用下形成微生物-毒素的復(fù)合體。

伏馬毒素是由鐮刀菌屬在一定的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物[4],種類較多,但其結(jié)構(gòu)存在相似性,如FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4等[5]都具有線狀碳原子(19或20)骨架,區(qū)別在于羥基、甲基及三羧酸等化學(xué)基團(tuán)位于骨架兩側(cè)的不同位點(diǎn)。在伏馬毒素眾多的種類中以FB1和FB2的危害性最大,能夠引起馬腦的白質(zhì)化和豬肺水腫,對人有致癌性[6],其中伏馬毒素FB1已經(jīng)被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B級致癌物[7]。隨著國際社會對伏馬毒素危害性認(rèn)識的加深,歐盟在2007年出臺了新的伏馬毒素在食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)[8],規(guī)定人用玉米制品中伏馬毒素的含量不能高于1000μg/kg,零食制品和嬰兒食品中的含量分別不能超過800和200μg/kg。

目前,已有大量文獻(xiàn)報道伏馬毒素的危害性[4-7],所以研究一種行之有效的方法來降低伏馬毒素的危害性顯得尤為重要。本研究針對玉米及其制品中大量存在并且對人體危害最大的FB1、FB2[9],采用乳桿菌對其進(jìn)行脫除研究。這項(xiàng)研究,為乳桿菌脫除糧食作物中的伏馬毒素提供了理論依據(jù),同時也為降低伏馬毒素對人體的危害提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌B7、戊糖乳桿菌X8 均由中國微生物菌種保藏中心提供;伏馬毒素FB1、FB2(≥99%,普瑞邦) 購于北京泰樂祺科技有限公司;三氯乙酸(TCA)、溶菌酶(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、鄰苯二甲醛(OPA) 購于北京市科百奧生物科技有限公司。

高效液相色譜 Waters;紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;反向Luna-C18色譜柱(4.6mm × 250mm ×5μm) phenomenex。

1.2 菌懸液的制備

將活化后的兩株菌按10%的接種量分別接種到MRS液體培養(yǎng)基中,在37℃條件下培養(yǎng)18～20h。培養(yǎng)完成后,將培養(yǎng)液離心,收集菌體。將菌體用無菌水洗滌兩次后,在600nm下測其OD值調(diào)菌懸液的濃度到108數(shù)量級。

1.3 菌體對伏馬毒素吸附率的測定

取供試菌懸液1mL離心(4000×g,4℃,10min)收集菌體,加入990μL無菌水(乳酸調(diào)pH=3.0),伏馬毒素FB1和FB2工作液(乙腈-水(1∶1 v/v)溶解)各5μL,得到含伏馬毒素FB1和FB2各5μg/mL的菌懸液。將該菌懸液靜置1h后,離心(3000×g,4℃,5min)收集上清液,過膜(0.22μm水溶膜)后進(jìn)樣檢測。以5μg/mL伏馬毒素(FB1+FB2)水溶液(1mL)為陽性對照[10]。

色譜條件:熒光檢測器(激發(fā)波長:335nm,發(fā)射波長:440nm);流動相(A液:乙腈,B液:0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液與甲醇溶液等體積混合并調(diào)pH=3.35);洗脫方式:梯度洗脫(A液在10min內(nèi)由10%增加到60%,在60%時保持7min后在1min內(nèi)將A液的比例由60%降低到10%)[11];流速:1mL/min;進(jìn)樣量:5μL。

衍生化處理:衍生液鄰苯二甲醛與待測液以3∶1的比例混合后,進(jìn)樣。整個過程必須在2min內(nèi)完成。

伏馬毒素的脫除率(%)=[1-(上清液中伏馬毒素的含量/空白樣中伏馬毒素的含量)]×100

1.4 伏馬毒素對菌體生長的影響

把植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8分別按10%的接種量接種到含有伏馬毒素(FB1+FB2各5μg/mL)MRS液體培養(yǎng)基中,用菌落計數(shù)法繪制0、4、8、12、16、20、24、48、72、96h的菌體生長曲線。以不含伏馬毒素的培養(yǎng)基繪制的生長曲線作為對照。

1.5 菌體吸附伏馬毒素與菌體活力的關(guān)系

取1mL含伏馬毒素(FB1+FB2各5μg/mL)的供試菌懸液,在常溫下培養(yǎng)1h,離心(3000×g,4℃,5min)收集菌體。菌體洗滌一次后,重懸于1mL生理鹽水中,梯度稀釋后選擇合適梯度倒平板,48h后進(jìn)行菌落計數(shù),觀察菌體的生長狀況。以不含伏馬毒素的1mL菌懸液作為對照。

1.6 影響菌體吸附伏馬毒素的因素

pH:配制0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,分別調(diào)pH為3、4、5、6;配制0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液并調(diào)pH分別為7、8、9。取兩株供試菌懸浮于上述pH緩沖液中,制備成含伏馬毒素(FB1+FB2各5μg/mL)的供試菌懸液。在常溫下靜置1h后,離心(3000×g,4℃,5min)收集上清液,過膜后進(jìn)樣檢測。以不含菌體的緩沖液與伏馬毒素工作液混合為對照。

冷凍及熱處理:取兩株供試菌懸液(按1.2操作)分別進(jìn)行以下兩種處理:在-20℃條件下冷凍,備用;在121℃條件下加熱15min。

酸處理:取1mL供試菌懸液,離心(4000×g,4℃,10min)收集菌體,無菌水洗滌兩次,將菌體懸浮于1mol/L的HCl中沸水浴15min。

酶及化學(xué)處理:對兩株供試菌懸液進(jìn)行離心、無菌水洗滌后,向菌體沉淀內(nèi)加入5mL 10%的三氯乙酸(TCA),沸水浴15min后迅速冷卻;加入2mL的溶菌酶(45000U)37℃搖床(90r/min)震蕩12h。

按上述方法處理后的菌懸液離心洗滌三次,用1.3的方法測定菌體對伏馬毒素的吸附率。未經(jīng)處理的菌體作為對照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,做t檢驗(yàn)及方差分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 伏馬毒素對菌體生長的影響

從圖1可以看出,在菌體生長期的前24h內(nèi),伏馬毒素對植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8基本沒有影響,菌體的數(shù)量級都在107CFU/mL以上。植物乳桿菌B7在24h以后,菌體數(shù)量開始明顯下降;而戊糖乳桿菌X8在48h以后,菌體的數(shù)量才有所下降。由此說明,伏馬毒素在菌體生長的對數(shù)期和平穩(wěn)期內(nèi)對兩株供試菌的生長并沒有產(chǎn)生太大的影響。

圖1 伏馬毒素對植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8生長的影響Fig.1 Effects of fumonisins FB1 and FB2 on the growth of L. plantarum B7 and L. pentosus X8注:a:植物乳桿菌,b:戊糖乳桿菌。

2.2 吸附伏馬毒素后菌體的生長狀況

由表1可以看出,在菌體與伏馬毒素共同培養(yǎng)完成吸附后,對菌體進(jìn)行平板菌落計數(shù)測定的菌體活力并沒有顯著性的變化,菌落數(shù)依然保持在108數(shù)量級。說明5μg/mL的伏馬毒素沒有影響植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8的活力。

表1 吸附伏馬毒素FB1、FB2后菌體的生長情況(Lg(CFU/mL))Table1 Growth of the strains B7 and X8 bound to fumonisins FB1 and FB2(Lg(CFU/mL))

注:菌體吸附伏馬毒素后的菌落數(shù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,實(shí)驗(yàn)做三次平行。

2.3 影響菌體吸附伏馬毒素的因素

2.3.1 菌體的活性 冷凍解凍,熱滅活的處理后的菌體與未做處理的菌體相比較,兩株菌脫除伏馬毒素的能力并沒有受到顯著影響(p>0.05),說明菌體的活性與菌體脫除毒素的能力無關(guān)。同時,說明菌體脫除毒素的效果是物理吸附而不是降解作用。圖2所示熱滅活后的菌體對伏馬毒素的吸附能力略高于對照組,這一現(xiàn)象可能與熱處理改變了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有關(guān)[8]。

圖2 菌體活性的影響Fig.2 Effects of activity on binding FB1和FB2

2.3.2 pH pH對B7和X8吸附伏馬毒素的影響顯著。由圖3可以看出,兩株菌體對伏馬毒素的吸附率隨pH的升高而降低;在pH為3時,兩株菌吸附伏馬毒素的能力較高,B7和X8對伏馬毒素FB2的吸附率都在80%以上,對FB1的吸附率也在50%以上。但當(dāng)pH≥7時,兩株菌體對FB1的吸附率都趨近于0,對FB2的吸附率較pH<7時降低明顯。這可能與pH對菌體細(xì)胞壁的作用及FB1、FB2結(jié)構(gòu)上的差異有關(guān)。其次,同一pH下,植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8吸附伏馬毒素的能力存在菌株間的差異。戊糖乳桿菌X8對FB1的吸附率明顯高于植物乳桿菌B7;在pH分別為5和6時,X8對FB2的吸附率高于B7的程度更加顯著(p<0.01)。

圖3 pH對植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8吸附伏馬毒素的影響Fig.3 Effects of pH on binding FB1 and FB2 by L. plantarum B7and L. pentosus X8注:(a)植物乳桿菌；(b)戊糖乳桿菌。

2.3.3 化學(xué)/酶處理 由表2可見,經(jīng)HCL和10% TCA處理的菌體,吸附伏馬毒素的能力都有所增加,特別是植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8對FB1的吸附率提高顯著(p<0.01);而經(jīng)溶菌酶處理過的菌體,其對伏馬毒素的吸附能力下降明顯(p<0.01)。B7和X8對FB1的吸附率降到了10%以下,而吸附率較高的FB2分別下降到了13%和26%。

表2 化學(xué)處理及酶處理對植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8吸附伏馬毒素FB1、FB2的影響Table2 Effect of chemical and enzymatic treatments of bacteria on binding of fumonisin B1 and B2 by Lactobacillus plantarum B7 and Lactobacillus pentosus X8

注:**:差異性顯著(p<0.01)。3 討論與結(jié)論

伏馬毒素危及人類和動物的健康,乳桿菌吸附毒素后可以減少胃腸道對伏馬毒素的吸收,進(jìn)而可能降低對人畜的危害[9]。目前,去除伏馬毒素的研究大多數(shù)還停留在物理和化學(xué)方法上,鮮有文章研究乳桿菌對伏馬毒素的脫除作用。

本研究選用植物乳桿菌B7和戊糖乳桿菌X8對伏馬毒素的脫除作用進(jìn)行研究,證實(shí)兩株乳桿菌能較好地脫除伏馬毒素。從兩株乳桿菌的生長過程看,5μg/mL伏馬毒素幾乎對菌體的生長沒有影響,且吸附毒素后菌體的活菌數(shù)并沒有降低。這表明在發(fā)酵過程中乳桿菌或許具有脫除伏馬毒素的能力。冷凍解凍處理對兩株乳桿菌脫除FB1和FB2并沒有產(chǎn)生顯著的影響;而熱滅活處理提高了菌體脫除毒素的能力,這說明菌體的活性并不影響其對毒素的脫除,與生理代謝作用無關(guān)。pH、熱處理、化學(xué)處理和酶處理等能顯著改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的一些方式都會提升或降低乳桿菌結(jié)合伏馬毒素的效果,推測乳桿菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)可能與菌株脫除伏馬毒素的能力相關(guān)。

在乳桿菌脫除伏馬毒素的過程中,菌體吸附伏馬毒素的能力隨pH的升高而降低。同時,pH對兩株乳桿菌的影響存在差異(圖3和圖4),這可能與構(gòu)成細(xì)胞壁骨架的肽聚糖的差異性有關(guān)。pH之所以是影響菌體吸附伏馬毒素的重要因素,一方面是因?yàn)樵谒嵝詶l件下,細(xì)胞壁多糖中的糖苷鍵發(fā)生斷裂,釋放出游離的單糖,細(xì)胞壁表面的蛋白質(zhì)及肽鏈中的硫胺鍵遭到破壞,使原有細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,削弱了細(xì)胞壁的致密性,增加了毒素與細(xì)胞壁間的相互作用,這也是具有完整結(jié)構(gòu)的菌體不能夠達(dá)到的[12];另一方面,伏馬毒素的三羧酸結(jié)構(gòu)是與菌體細(xì)胞壁相互作用的重要部位[10],在酸性條件下,可能抑制了三羧酸結(jié)構(gòu)的水解,使之能更好地與細(xì)胞壁結(jié)合。

加熱和酸處理都能夠提高菌體對伏馬毒素的脫除能力(表2),因?yàn)檫@些處理都改變了菌體細(xì)胞壁的表面結(jié)構(gòu),暴露出更多與伏馬毒素結(jié)合的位點(diǎn)。El-Nezami在黃曲霉毒素B1和玉米烯酮的研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)[13]。

李瑩等[14]比較了用10% TCA法、苯酚法、SDS法、TX-100法去除細(xì)胞壁中的磷壁酸的效果后發(fā)現(xiàn),10% TCA能夠有效去除細(xì)胞壁中的磷壁酸,很好的增加細(xì)胞壁的通透性。所以,兩株乳桿菌在10% TCA蒸煮處理15min后,細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)變得疏松,暴露出更多能夠與伏馬毒素結(jié)合的位點(diǎn),其吸附伏馬毒素的能力顯著提高(p<0.01)。溶菌酶處理菌體后,菌體對伏馬毒素的吸附能力明顯降低(p<0.01),這是因?yàn)槿芫改軌蛩庑纬删厶枪羌艿摩?1,4糖苷鍵[15],徹底打破了肽聚糖的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),導(dǎo)致吸附毒素的能力降低。

綜上,在與伏馬毒素FB1和FB2共同培養(yǎng)時,乳桿菌的生長和活菌數(shù)量沒有受到顯著影響,且具有結(jié)合伏馬毒素的能力;改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的各種處理方式都有助于提高乳桿菌吸附FB1和FB2的效果,但破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的處理方式(如溶菌酶)會降低菌體吸附FB1和FB2的效果。這說明菌體細(xì)胞脫除毒素的能力主要是生物吸附而非生物降解,菌體吸附毒素的能力與其本身的活性無關(guān),而是與其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。然而,細(xì)胞壁上的何種成分以及通過何種相互作用方式來吸附伏馬毒素仍然有待進(jìn)一步探究。

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Study on the removal of fumonisins byLactobacillusstrains

WANG Xiao1,ZHENG Jun-yu1,PENG Xiao-long1,QIAO Ya-fei2,ZHOU Fang1,ZHAO Li-li1,ZHANG Bo-lin1

(1.Department of Food Science,College of Biological Science and Biotechnology,Beijng Forestry Univeisity,Beijing 100083,China;2.College of Food Science and Technology,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)

The ability ofLactobacillusplantarumB7 andL.pentosusX8 to bind fumonisins was studied. The removal of fumonisins,FB1 and FB2 by strains B7 and X8 was detected by reversed-phase HPLC with fluorescence detector. The percentage of FB1-binding was 52.9% for strain B7 and 58.0% for strain X8 respectively. Results showed that more FB2 was bond to two strains when incubated at 37℃ for 1h. The removal percentage of FB2 by strains B7 and X8 was 85.2% and 86.5%,respectively. Factors which affect the ability of the two strains to remove FB1and FB2 included temperature,pH and enzyme. The fumonisins-binding does not depend on the activity of the two lactobacilli strains. The higher pH values,the less the removal percentage of fumonisins by the two strains. No fumonisins-binding by strain B7 and X8 was detected when pH was larger than 7. The cells of two lactobacilli strains subjected to the pretreatment of boiled water for 15min showed higher removal of fumonisins than their controls. The lysozyme was used to treat the cells of two lactobacilli strains significantly reduced their ability to bind fumonisins. The selected two lactobacilli strains should be potential candidates as a biological detoxification agent for the remove of fumonisins via their physical binding,although more FB2 was removed than FB1.

Lactobacillus;fumonisins;influences;removal

2014-06-27

王曉(1988-),女,碩士,研究方向:食品微生物。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)的項(xiàng)目(2006AA10Z344);“益生菌定向篩選與功能開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)”(2008AA10Z335)。

TS201.3

A

:1002-0306(2015)09-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.027