趙生國，唐紅杰，焦 婷，劉立山，周 瑞，徐振飛(.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 70070； .甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 70070；.慶陽市農(nóng)業(yè)科學研究院， 甘肅 慶陽 745000)

動物生產(chǎn)層

早勝牛A-FABP基因SNPs與胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的關(guān)系

趙生國1，唐紅杰1，焦 婷2，劉立山1，周 瑞1，徐振飛3
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070；3.慶陽市農(nóng)業(yè)科學研究院， 甘肅 慶陽 745000)

為研究早勝牛(Bostaurus)A-FABP基因多態(tài)性與胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，采用PCR-SSCP方法對5個早勝牛群體(慶陽群體、平?jīng)鋈后w、南德溫與慶陽雜種群體、西門塔爾與平?jīng)鲭s種群體、秦川與平?jīng)鲭s種群體)A-FABP基因型進行了測定，并分析其多態(tài)性與胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，A-FABP基因第2外顯子區(qū)c.280A>G，并檢測到3種基因型AA、AG和GG。對屠宰后胴體和肉質(zhì)性狀相關(guān)分析表明，基因型AG屠宰率極顯著高于AA(P<0.01)，而凈肉率GG極顯著高于AA(P<0.01)；基因型AG剪切力顯著低于AA(P<0.05)。由此認為A-FABP基因突變位點可作為早勝牛胴體性狀和肉質(zhì)性狀遺傳標記。

早勝牛，A-FABP基因； SNPs； 胴體品質(zhì)； 肉質(zhì)性狀

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(Adipocyte Fatty Acid Binding-protein Gene，A-FABP)主要在脂肪細胞中表達，在甘油三酯形成及脂肪分解過程中對脂肪生成或溶解起調(diào)控作用[1]。Wulf等[2]將牛(Bostaurus)的該基因定位在14號染色體上，其625 bp的mRNA編碼了132個氨基酸。有研究表明雞(Gallusgallus)[3]和豬(Susscrofa)[4]的A-FABP基因只在脂肪組織中表達，其有利于肌內(nèi)脂肪含量的增加，且雞[5-6]、鴨(Anasplatyrhynchos)[7]、豬[8]和牛[9-11]等的A-FABP基因變異可能影響肌間脂肪(IMF)沉積，而Armstrong等[12]進一步表明該基因可作為肌肉大理石花紋的候選基因，且對皮下脂肪和背部脂肪[13]厚度都存在影響。鑒于此，本研究利用PCR-SSCP技術(shù)對5個甘肅早勝牛群體的A-FABP基因第2外顯子多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性進行了分析，以期篩選甘肅地方牛種肉質(zhì)性狀相關(guān)分子標記，為良種肉牛選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用取樣器采集牛耳組織，置于75%酒精中在-20 ℃保存，采用常規(guī)的酚/氯仿法[14]提取基因組DNA，TE溶解后對DNA質(zhì)量進行檢測，然后稀釋成100 ng·μL-1備用。

隨機選取慶陽群體和西雜牛69頭進行胴體性狀測定，屠宰前稱重，屠宰后分別測定胴體性狀(胴體重、屠宰率、胴體背膘厚、眼肌面積、凈肉率)和肉質(zhì)性狀(大理石花紋等級、肉色、失水率、剪切力、pH值、蒸煮損失)，所檢測個體為相同條件下無親緣關(guān)系的22月齡健康閹牛，參照《養(yǎng)牛學》[15]方法進行測定。

1.2 引物設(shè)計及PCR擴增體系

采用Primer Premier 5.0軟件，以EMBL(ENSBTAT00000000079)發(fā)表的牛A-FABP基因序列為參照，設(shè)計A-FABP基因第2外顯子引物(由上海生物工程有限公司合成)。引物序列：Forward primer：5‘-GGGGTGTGGTCACCATTAAA-3’，Revserse primer：5’-TGGTTTGCTATAGGCAGCAG - 3’，PCR反應總體系25 μL：Premix Taq 12.5 μL(1.25 U)，基因組DNA 1 μL(100 ng·μL-1)，引物各0.5 μL(10 pmol·μL-1)，ddH2O 10.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸140 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，反應結(jié)束后 4 ℃保存。

1.3 擴增產(chǎn)物檢測及SSCP分型

產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取2 μL加入到8 μL上樣液[去離子甲酰胺(98%)、pH 8.0的10 mmol·L-1EDTA、二甲苯氰FF(0.025%)、溴酚藍(0.03%)]中，經(jīng)96 ℃變性12 min后冰浴15 min，采用12%丙烯酰胺凝膠(Acr∶Scr=29∶1)檢測，160 V電泳10 h后銀染。

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

1.4 測序

根據(jù)SSCP分型結(jié)果，挑選不同基因型的個體PCR擴增產(chǎn)物送至北京三博生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SSCP分型結(jié)果計算基因型頻率和等位基因頻率，利用PopGen 3.2分別計算純合度(Ho)和雜合度(He)及有效等位基因數(shù)(Ne)，進行Hardy-Weinberg平衡檢驗和卡方獨立性檢驗，計算多態(tài)信息含量(PIC)。用SPSS 19.0的GLM(General linear model)完成模型Yij=μ+GENi+LOCj+(GEN×LOC)ij+eij(Yij：個體某性狀表型值；μ：群體均值；GENi：基因型效應；LOCj：地區(qū)效應；GEN×LOC)ij：基因型與地區(qū)的互作效應；eij：隨機誤差)的最小二乘方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSCP分型及測序結(jié)果分析

SSCP分型表明存在3種基因型(圖1)，測序結(jié)果與發(fā)表在GenBank中的序列(NM174314)進行比對，在A-FABP基因第2外顯子c.A280>G處發(fā)現(xiàn)一個突變位點，即A→G堿基突變(圖2)。

2.2 A-FABP基因遺傳多態(tài)性分析

根據(jù)SSCP檢測結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，5個群體的A-FABP基因中，GG基因型頻率均低于AG基因型頻率(表2)。在5個早勝牛群體中，除南雜牛和秦雜牛A等位基因頻率均高于G等位基因頻率表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因外，其他3個群體G等位基因頻率均高于A等位基因頻率。χ2適合性檢驗表明，平?jīng)鋈后wc.280A>G的χ2值沒有達到顯著水平，說明基因型處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，其他4個群體處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)(P<0.05)。

圖1 早勝牛A-FABP基因第2外顯子PCR-SSCP檢測結(jié)果Fig.1 The 2nd exon ofA-FABPgene in Zaoshen Cattle detection by PCR-SSCP

注：從左到右的5個泳道分為別早勝牛慶陽群體中的QZ4和QZ5個體(AG基因型)、QZ17和QZ56個體(AA基因型)、QZ72個體為(GG基因型)。

Note: Individual of QZ4 and QZ5(AG), QZ17 and QZ56(AA), QZ72(GG) in Qingyang population of Zaosheng Cattle showed in five channels from left to right.

圖2 A-FABP基因第2外顯子測序結(jié)果Fig.2 The sequence results of the 2nd exon ofA-FABPin Zaosheng Catttle

注：純合子AA在第280位置為堿基A，雜合子AG在第280位置的堿基分別為A和G，純合子GG在第280位置為堿基G。

Note: Homozygous AA at position 280 is the base A, heterozygous AG at the position 280 is base A and G, GG homozygous at position 280 is the base G.

表2 A-FABP第2外顯子基因型頻率和基因頻率Table 2 Frequencies of genotypes and alleles of the 2nd exon inA-FABP

注：括弧中的數(shù)字是各群體中具有不同基因型的個體數(shù)。

Note： Individual numbers of genotype in each population were shown in brackets.

χ2獨立性檢驗表明(表3)，秦雜牛、南雜牛與西雜?；蛐头植疾町愶@著(P<0.05)，且與平?jīng)龊蛻c陽群體基因型分布差異極顯著(P<0.01)；其他群體間基因型分布差異不顯著(P>0.05)。

表3 A-FABP基因第2外顯子基因型獨立性檢驗Table 3 The independent test of genotypes in the 2nd exon inA-FABPgene

注：*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note: *, significant difference at 0.05 level; **, extremely significant difference at 0.01 level. The same below.

表4表明了5個群體A-FABP基因第2外顯子c.280A>G位點的純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)及多態(tài)信息含量(PIC)。慶陽早勝牛群體的純合度最高(0.502 6)和雜合度最低(0.497 4)，而西門塔爾牛與早勝牛平?jīng)鲭s交群體純合度最低(0.492 6)和雜合度最高(0.507 4)；秦川牛與早勝牛平?jīng)鲭s交群體有效等位基因數(shù)最多(1.999 2)；其中各群體PIC含量約為0.37，處于中度多態(tài)(0.25

表4 A-FABP基因遺傳多態(tài)性分析Table 4 The genetic polymorphisms ofA-FABPgene

注：PIC<0.25為低度多態(tài)，0.250.5為高度多態(tài)。

Note:PIC<0.25 means low diversity, 0.250.5 means high diversity.

2.3 基因型與胴體、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析

對A-FABP基因第2外顯子不同基因型中的7個胴體性狀進行方差分析發(fā)現(xiàn)，AG基因型屠宰率極顯著高于AA(P<0.01)、GG凈肉率極顯著高于AA(P<0.01)，3個基因型間的其他性狀差異不顯著(P>0.05)(表5)。

對A-FABP基因第2外顯子不同基因型的6個肉質(zhì)性狀(肉色、切力、失水率、大理石花紋和剪蒸煮損失及pH值)分析發(fā)現(xiàn)(表6)，AG基因型剪切力顯著低于AA(P<0.05)，基因型間其他性狀差異不顯著(P>0.05)。

表5 A-FABP基因型與胴體性狀關(guān)聯(lián)分析Table 5 Correlation of polymorphism ofA-FABPgene with carcass traits

表6 A-FABP基因基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)系Table 6 Correlation of genotype ofA-FABPgene with meat quality

3 討論與結(jié)論

3.1 A-FABP基因第2外顯子變異分析

研究表明在秦川牛A-FABP基因第1內(nèi)含子和第4外顯子上發(fā)生突變[9]，而且發(fā)現(xiàn)魯西牛、南陽牛、郟縣紅牛和夏南牛等國內(nèi)地方牛中該基因兩端側(cè)翼序列及第2和3外顯子也存在變異[16]，朝鮮牛2、3、4外顯子也存在突變位點[17]。本研究對早勝牛及其雜交群體A-FABP基因第2外顯子的研究發(fā)現(xiàn)，因編碼區(qū)c.280A>G變異位點的存在而界定出3種基因型(AA、AG、GG)，Dong-yep等[17]對朝鮮牛A-FABP基因中的檢測中也發(fā)現(xiàn)了這一突變位點[17]。χ2適合性檢驗表明，平?jīng)鋈后w的基因型符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，表明在遺傳漂變、遷徙和人工選育等相互作用下處于動態(tài)平衡中；而其他4個群體處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)(P<0.05)，說明自然選擇或者人工選擇對基因分布產(chǎn)生了較大影響，造成了分布上的不平衡，可能與高強度選擇有關(guān)。χ2獨立性檢驗結(jié)果表明，秦雜牛、南雜牛與西雜牛基因型分布差異顯著(P<0.05)，且與平?jīng)鋈后w和慶陽群體差異極顯著(P<0.01)，證實不同群體間存在遺傳差異，由于遺傳背景及選擇壓力的差異，形成了不同程度的變異。Chakraborty等[18]認為有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)是衡量群體遺傳多態(tài)性的主要指標，且其值具有一致性。5個群體的多態(tài)信息含量均為0.37，處于中度多態(tài)(0.25

3.2 基因多態(tài)性與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性

Wood等[19]研究認為，肌內(nèi)脂肪(Intramuscular Fat,IMF)含量與肉的嫩度和風味有直接關(guān)系，而A-FABP基因是影響動物肌內(nèi)脂肪含量的重要候選基因[10]。

對秦川牛的A-FABP基因多態(tài)性研究表明，牛肉嫩度、背膘厚及大理石花紋等指標與第1內(nèi)含子上的變異有關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)第4外顯子上的純合基因型GG個體的背膘厚和嫩度值及大理石花紋評分顯著高于CC[9]。劉艷妍[16]研究發(fā)現(xiàn)兩端側(cè)翼序列與牛的產(chǎn)肉性狀相關(guān)；第2外顯子的變異與屠宰率、嫩度、眼肌面積和胴體長相關(guān)；第3外顯子及3′側(cè)翼序列變異分別與眼肌面積和胴體深相關(guān)。Cho等[13]和Dong-yep等[17]分別對該基因外顯子2和3的研究也得到了相同結(jié)果。Barendse等[20]認為，在外顯子3和內(nèi)含子3之間存在的剪接位點突變與澳大利亞肉牛肌間脂肪沉積顯著相關(guān)。

Dong-yep等[17]報道了與本研究相同的研究結(jié)果，即在A-FABP基因第2外顯子上存在錯義突變位點c.280A>G，該堿基突變導致編碼的異亮氨酸(IIe)變?yōu)槔i氨酸(Val)，可能會導致蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響其功能的發(fā)揮。該SNPs與朝鮮牛的胴體重、背膘厚相關(guān)性未達到顯著水平，這與本研究結(jié)果基本一致?；蛐虯A屠宰率極顯著高于AG(P<0.01)、AA凈肉率顯極顯著高于GG，基因型AG剪切力顯著低于AA(P<0.05)。對A-FABP基因變異位點與牛體胴體品質(zhì)和肉質(zhì)等主要經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析，認為A-FABP多態(tài)位點可作為肉牛肉質(zhì)性狀遺傳效應的分子標記。

[1] Hertzel A V,Bennaars-Eiden A,Bernlohr D A.Increased lipolysis in transgenic animals over expressing the epithelial fatty acid binding protein in adipose cells[J].Journal of Lipid Research,2002,43:2105-2111.

[2] Wulf D M,Tatum J D,Green R D,Morgan J B,Golden B L,Smith G C.Genetic influences on beef longissimus palatability in Charolais-sired and Limousin-sired steers and heifers[J].Journal of Animal Science,1996,74:2394-2405.

[3] 羅桂芬,陳繼蘭,文杰,趙桂蘋,鄭麥青,孫世鐸.雞A-FABP基因多態(tài)性分析及其與脂肪性狀的相關(guān)研究[J].遺傳,2006,28(1):39-42.

[4] 李楨,儲明星,曹紅鶴,李紅濱,馬月輝,鄭友民,周忠孝.中外11個豬種A-FABP基因微衛(wèi)星遺傳變異的研究[J].遺傳,2004,26(4):473-477.

[5] 葉滿紅,文杰,曹紅鶴,李紅濱,陳繼蘭,趙桂蘋,鄭麥青.脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白基因多態(tài)性與雞肉品質(zhì)性狀的關(guān)系研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2007,38(6):526-532.

[6] 葉滿紅.雞脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆及其與肌內(nèi)脂肪的關(guān)系[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院博士論文,2003.

[7] 趙旭庭,段修軍,董飚,張紅,張軍,龔道清.鴨A-FABP基因單核苷酸多態(tài)性分析及其與體脂性狀相關(guān)的研究[J].揚州大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版),2009,30(1):38-41.

[8] 王存芳.豬H-FABP和A-FABP基因的多態(tài)性及其與肌內(nèi)脂肪性狀關(guān)系的研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學碩士論文,2002.

[9] 王卓.秦川牛H-FABP、A-FABP和E-FABP基因SNPs及其與部分肉用性狀關(guān)聯(lián)分析[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學碩士論文,2005:35-36.

[10] Michal J J,Zhang Z W,Gaskins C T,Jiang Z.The bovine fatty acid binding protein 4 gene is significantly associated with marbling and subcutaneous fat depth in Wagyux limousin F2 crosses[J].Animal Genetics,2006,37:400-402.

[11] 王金浩,文生萍,饒華,賈俊靜,李琦華,葛長榮,曹振輝.影響牛肉品質(zhì)的主效基因[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報,2008,23(5):693-696.

[12] Armstrong M K,Bernlohr D A,Strorch J,Clarke S D.The purification and characterization of a fatty acid binding protein specific to pig adipose tissue[J].Biochemical Journal,1990,267(2):373-378.

[13] Cho S,Park T S,Yoon D H,Cheong H S,Namgoong S,Park B L,Lee H W,Han C S,Kim E M,Cheong I C,Kim H,Shin H D.Identification of genetic polymorphisms in FABP3 and FABP4 and putative association with back fat thickness in Korean native cattle[J].Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2008,41(1):29-34.

[14] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[M].2nd edition.Beijing:Science Press,1994:464-467.

[15] 王根林.養(yǎng)牛學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006.

[16] 劉艷妍.牛A-FABP基因的多態(tài)性及其與秦川牛肉用性狀的關(guān)聯(lián)分析[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學碩士論文,2010.

[17] Dong-yep O,Yoon-seok L,Boo-mi L.Identification of the SNP (Single Nucleotide Polymorphism) for fatty acid composition associated with beef flavor-related FABP4 (Fatty Acid Binding Protein 4) in Korean Cattle[J].Animal Science,2012,25:913-920.

[18] Chakraborty R,Zhong Y,De A M.Linkage disequilibria among (CA) polymorphism in the human dystrophin gene and their implications in carrier detection and prenatal diagnosis in duchenne and becker muscular dystrophies[J].Genomics,1994,21:567-570.

[19] Wood J D,Enser M,Moncrieff C B,Kempster A J.Effects of carcass fatness and sex on the composition and quality of pig meat[A].34th International Congress of Meat Science and Technology[C].Brisbane,Elsevier,1988:562-564.

[20] Barendse W,Bunch R J,Thomas M B,Harrison B E.A splice site single nucleotide polymorphism of the fatty acid binding protein 4 gene appears to be associated with intramuscular fat deposition in longissimus muscle in Australian Cattle[J].Animal Genetics,2009,40:1365-2052.

(責任編輯 張瑾)

Correlation analysis between SNPs ofA-FABPgene and characteristics of carcass and meat quality in Zaosheng Cattle

ZHAO Sheng-guo1, TANG Hong-jie1, JIAO Ting2, LIU Li-shan1, ZHOU Rui1, XU Zhen-fei3
(1.Faculty of Animal Science and Technology, Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China;2.Faculty of Pratacultural Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;3.Qingyang Academy of Agricultural Search, Qingyang 745000, China)

In order to study the polymorphism ofA-FABPgene and its correlation with the characteristics of carcass and meat quality in Zaosheng cattle (Bostaurus), the SNPs ofA-FABPgene in five groups of Zaosheng cattle (Qingyang, Pingliang, Hybrid of Qingyang with South Devon, Hybrid of Simmental with Pingliang and Hybrid of Qinchuan with Pingliang) were detected using PCR-SSCP and their characteristics of carcass and meat quality were analyzed. The results showed that there was a base mutation at c.280 A>G ofA-FABPgene in exon 2 which lead to three genotypes AA, AG and GG. The statistical correlation analysis indicated that dressing percentage of AG genotype was extremely significantly higher (P<0.01) than that of AA genotype. Percentage of net meat in GG genotype was extremely significantly higher (P<0.01) than that of AA genotype. The WBSF of AA genotype was significantly higher (P<0.05) than that of AG genotype. These results suggested that the site mutation ofA-FABPgene could be considered as maker to carcass and meat quality.

Zaosheng cattle;A-FABPgene; SNPs; carcass quality; meat quality traits

ZHAO Sheng-guo E-mail:zhaosg@gsau.edu.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0316

2014-07-02 接受日期：2014-09-29

甘肅省高等學?？蒲许椖?2013A-069)

趙生國(1976-)，男，甘肅慶城人，講師，博士，研究方向為動物遺傳資源保護與利用。E-mail:zhaosg@gsau.edu.cn

S823

A

1001-0629(2015)07-1150-06*

趙生國，唐紅杰，焦 婷，劉立山，周 瑞，徐振飛.早勝牛A-FABP基因SNPs與胴體品質(zhì)和肉質(zhì)性狀的關(guān)系[J].草業(yè)科學,2015,32(7):1150-1155.

ZHAO Sheng-guo,TANG Hong-jie,JIAO Ting,LIU Li-shan,ZHOU Rui,XU Zhen-fei.Correlation analysis between SNPs ofA-FABPgene and characteristics of carcass and meat quality in Zaosheng Cattle[J].Pratacultural Science，2015,32(7)：1150-1155.