張文博，吳 闖

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001）

甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)的急性毒性研究

張文博，吳 闖

（遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001）

為評(píng)估甲醛對(duì)水環(huán)境的毒性影響，以美國(guó)大鹽湖鹵蟲(chóng)為受試生物，采用概率單位法研究了甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)的急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：在25 ℃條件下，甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)的24 h LC50為16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.277 mg·L-1；48 h LC50為4.783 mg·L-1，95%置信限度：4.450～5.105 mg·L-1。培養(yǎng)48 h甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)的致死作用比24 h顯著增加，且48 h濃度響應(yīng)范圍也小于24 h響應(yīng)范圍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)鹵蟲(chóng)中毒后癥狀與已報(bào)道的其他物質(zhì)中毒癥狀有所不同。

甲醛；鹵蟲(chóng)；急性毒性；概率單位法

甲醛常溫下是一種無(wú)色、有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體，易溶于水及醇、醚等多種有機(jī)溶劑。近年來(lái)，由于生活水平的提高，由室內(nèi)裝修和各種消費(fèi)品使用造成的室內(nèi)甲醛污染已經(jīng)引起人們的高度重視，其對(duì)人體及小鼠等生物的毒性危害及中毒機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了大量研究[1,2]。同時(shí)，甲醛作為一種重要的有機(jī)原料在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，產(chǎn)生了大量含甲醛廢水，對(duì)環(huán)境的危害同樣巨大，因此甲醛對(duì)水體的污染及其對(duì)水生生物毒性也在日益引起關(guān)注[3]。目前對(duì)于水生生物的毒性研究多見(jiàn)于水產(chǎn)養(yǎng)殖品種及個(gè)別模式生物[4-6]。鹵蟲(chóng)作為一種環(huán)境監(jiān)測(cè)生物，其急性毒性試驗(yàn)已經(jīng)被國(guó)際會(huì)議確定并標(biāo)準(zhǔn)化[7]。其具有生活周期短、對(duì)毒物敏感、易于保存和培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于水生生物毒理學(xué)研究中。本文以大鹽湖鹵蟲(chóng)卵為對(duì)象，進(jìn)行甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)急性毒性的研究，為水體環(huán)境監(jiān)測(cè)及甲醛廢水處理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及生物學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 受試生物

以美國(guó)大鹽湖鹵蟲(chóng)（Artemia.francisana）作為受試生物，購(gòu)自天津中鹽制鹽工程技術(shù)研究院。與國(guó)產(chǎn)鹵蟲(chóng)卵相比，大鹽湖鹵蟲(chóng)卵質(zhì)量更高，孵化率和成活率都較高，且更易培養(yǎng)。鹵蟲(chóng)卵在光照培養(yǎng)箱中孵化，孵化條件為(25±1)℃，2 000 lux光照，光照時(shí)間比為12:12（光照，黑暗），小型氣泵充氣攪拌。選取24 h內(nèi)孵出的鹵蟲(chóng)，轉(zhuǎn)移至另外容器在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，得到Ⅱ～Ⅲ齡的鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體。

1.2 試劑

甲醛分別采用37%水溶液（福爾馬林）和甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100μg/mL，100 mL）購(gòu)于北京盈澤納新化工技術(shù)研究院。

1.3 實(shí)驗(yàn)用水

實(shí)驗(yàn)用水采用人工海水，pH= 8.0±0.5，鹽度（35 ±1）‰，其組成為： 23.70 g·L-1NaCl、0.54 g·L-1KCl、6.29 g·L-1MgSO4·7H2O、4.5 g·L-1MgCl2·6H2O、0.15 g·L-1CaCl2、0.04 g·L-1NaHCO3和蒸餾水[8]。

1.4 預(yù)試驗(yàn)

用人工海水將福爾馬林稀釋成不同濃度，稀釋前提高人工海水鹽度，使稀釋后鹽度為（35±1）‰。于50 mL小燒杯中加入25 mL甲醛溶液，投入10只鹵蟲(chóng)幼體，分別在24 h和48 h觀察死亡情況，找出48 h使全部鹵蟲(chóng)未發(fā)生死亡的最高濃度和24 h全部死亡的最低濃度，以確定試驗(yàn)所需濃度范圍。

1.5 急性毒性試驗(yàn)

在300 mL燒杯中加入150 mL實(shí)驗(yàn)用甲醛人工海水溶液，該溶液由甲醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制至相應(yīng)濃度。每只燒杯投入30只Ⅱ～Ⅲ齡的鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體。每個(gè)水平設(shè)置2個(gè)平行組，取平均值作為結(jié)果，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。在光照培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)，(25±1)℃，2 000 lux光照，光照時(shí)間比為12:12（光照，黑暗）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不投餌不充氣。分別于培養(yǎng)24 h和48 h記錄各組鹵蟲(chóng)死亡數(shù)量，在解剖鏡下觀察，以10 s內(nèi)鹵蟲(chóng)幼體無(wú)明顯運(yùn)動(dòng)作為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)。用SPASS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用概率單位法求出24 h LC50和48 h LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗(yàn)確定甲醛濃度范圍

經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)，確定培養(yǎng)24 h和48 h甲醛濃度范圍分別如表1所示。在此范圍，死亡率隨濃度增加有明顯變化。

2.2 鹵蟲(chóng)的中毒癥狀觀察

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鹵蟲(chóng)中毒后有一段平穩(wěn)期，泳動(dòng)情況與對(duì)照組相比無(wú)異常，濃度越高這段平穩(wěn)期越短。平穩(wěn)期過(guò)后，泳動(dòng)速度明顯加快，最后短時(shí)間內(nèi)減慢至失去運(yùn)動(dòng)能力，沉入水底。對(duì)于甲醛中毒，鹵蟲(chóng)失去運(yùn)動(dòng)能力和死亡之間幾乎無(wú)過(guò)渡。

表1 試驗(yàn)用甲醛濃度Table 1 Concentration of formaldehyde in test mg·L-1

鹵蟲(chóng)對(duì)甲醛的中毒癥狀與其他物質(zhì)的中毒癥狀有所不同，如柴油使鹵蟲(chóng)活動(dòng)能力下降，運(yùn)動(dòng)遲緩直至沉在水底不停顫動(dòng)[9]；恩諾沙星也可以使鹵蟲(chóng)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩，肢角擺動(dòng)頻率下降，趨光性變?nèi)醯默F(xiàn)象[10]；而甲醛使鹵蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)更加活躍，并且極大縮短了從活動(dòng)減慢到死亡的時(shí)間，一旦沉入水底基本已經(jīng)死亡。這種差異顯示甲醛中毒和其他物質(zhì)中毒機(jī)理的不同，但具體機(jī)理如何，尚未見(jiàn)明確報(bào)道。本試驗(yàn)采取的死亡判定方法為觀察鹵蟲(chóng)10 s內(nèi)不動(dòng)即為死亡，正是以鹵蟲(chóng)上述中毒特點(diǎn)為依據(jù)，使得試驗(yàn)更加簡(jiǎn)單易行。這一點(diǎn)與有些報(bào)道所采用的針刺的方法有所不同[9]。

2.3 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

將試驗(yàn)結(jié)果用SPSS19.0軟件分析，表2為采用概率單位法計(jì)算24 h和48 h每組試驗(yàn)數(shù)據(jù)殘差及相應(yīng)的致死概率。其中濃度為取對(duì)數(shù)后的結(jié)果。

表2 單元計(jì)數(shù)和殘差Table 2 Cell count and residual

表3為經(jīng)過(guò)回歸計(jì)算后24 h和48 h各濃度預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)的死亡概率及其95%置信限度，為節(jié)省篇幅未全部列出。由表中可以看出，兩個(gè)時(shí)間組的死亡率均隨濃度增加而上升，但在24 h組中，發(fā)生死亡的濃度范圍較大，即隨濃度的增加死亡率上升較慢；在48 h組中，發(fā)生死亡的濃度范圍比較集中，即在該濃度范圍內(nèi)，死亡率隨濃度增加迅速上升。

表 4為軟件最后給出的回歸模型，Pearson 擬合度檢驗(yàn)結(jié)果表明概率單位與濃度對(duì)數(shù)曲線相關(guān)性顯著，所以回歸模型完全符合要求。24 h LC50為16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1；48 h LC50為 4.783 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1。

表3 置信限度Table 3 Confidence limits

甲醛毒性的研究較多見(jiàn)于哺乳動(dòng)物如小鼠和人等，對(duì)水生生物的毒性研究相對(duì)較少。鹵蟲(chóng)作為受試生物已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于水環(huán)境污染物的毒性評(píng)價(jià)和生態(tài)毒理學(xué)的研究[11]。它具有個(gè)體小、對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)靈敏、易于長(zhǎng)期保存和實(shí)驗(yàn)操作，并且可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量培養(yǎng)等特點(diǎn)，因而比其他水生受試生物如大型水蚤、貝類、斑馬魚(yú)等更具優(yōu)勢(shì)[12]，已被用來(lái)評(píng)估鉆井液[13]、重金屬離子[14]、農(nóng)藥[8]等有毒物質(zhì)及某些藻類[15]的生物毒性。有研究表明，甲醛對(duì)水蚯蚓的24 h LC50為24.28 mg·L-1，48 h LC50為20 mg·L-1[4]；對(duì)泥鰍的24 h LC50為461.23 mg·L-1，48 h LC50為425.32 mg·L-1[5]溞；對(duì)中華虎頭蟹Ⅱ期 狀幼體24 h LC50為 131.036 μL·L-1，48 h LC50為 110.296 μL·L-1[6]。相比之下，鹵蟲(chóng)對(duì)甲醛更加敏感，更適于對(duì)水中甲醛進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)。

表4 甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)幼體急性毒性效應(yīng)Table 4 The acute toxicity of formaldehyde on Artemia.francisana

市售甲醛試劑一般為37%～40%的甲醛溶液，其中為防止甲醛聚合有些產(chǎn)品中加入15%左右的甲醇作為阻聚劑。為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確，本試驗(yàn)中在預(yù)試驗(yàn)階段采用的市售甲醛試劑初步確定死亡濃度范圍，在正式試驗(yàn)中采用甲醛溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中甲醛含量較低抑制了聚合現(xiàn)象，并且濃度精確不含阻聚劑，可直接用于試驗(yàn)而無(wú)需再次標(biāo)定。目前一些文獻(xiàn)中的甲醛濃度實(shí)際是甲醛溶液濃度，對(duì)其毒性的評(píng)價(jià)與純甲醛相比是有區(qū)別的。

本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理采用 SPSS19.0軟件，它和SAS、BMDP并稱為國(guó)際上最有影響的三大統(tǒng)計(jì)軟件。在國(guó)際學(xué)術(shù)交流中，凡是用 SPSS軟件完成的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析，可以不必說(shuō)明算法，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果被國(guó)際同行廣泛認(rèn)可。該軟件能根據(jù)回歸模型，計(jì)算出各濃度對(duì)應(yīng)的概率，并給出95%置信限度，在進(jìn)行半致死濃度研究中非常方便。

3 結(jié) 論

甲醛對(duì)鹵蟲(chóng)的24 h LC50為16.765 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1；48 h LC50為4.783 mg·L-1，95%置信限度：15.105～18.227 mg·L-1。鹵蟲(chóng)對(duì)甲醛敏感，適于用來(lái)對(duì)其進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)。中毒48h對(duì)應(yīng)的死亡濃度范圍明顯小于中毒24 h，且甲醛中毒癥狀與其他物質(zhì)中毒癥狀不同，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Study on Acute Toxicity of Formaldehyde on Artemia.francisana

ZHANG Wen-bo，WU Chuang
（College of Chemistry, Chemical Engineering and Environmental Engineering, Liaoning Shihua University, Liaoning Fushun 113001，China）

For evaluating the toxicity of formaldehyde in aquatic environment, Artemia.francisana was used as test organism to study the acute toxicity of formaldehyde by probit method. The results show that, at 25 ℃ the 24 h LC50is 16.765 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 15.105～18.277 mg·L-1; the 48 h LC50is 4.783 mg·L-1, and its 95% confidence limit is 4.450～5.105 mg·L-1. The lethal effect of formaldehyde after 48 h culture is more significant than that of 24 h, and the concentration response range is also the same. The behavior response of Artemia.francisana to formaldehyde is different from other reagents reported.

Formaldehyde; Artemia.francisana; Acute toxicity; Probit

X 835

A

1671-0460（2015）08-1788-03

2015-07-13

張文博（1994-），男，遼寧沈陽(yáng)人，研究方向：生物化工。E-mail：zhangwbbio@sina.com。

吳闖（1973-），男，碩士，研究方向：生物工程。E-mail：wuchuang2000@sina.com。