湯小江，周瑜輝，張 偉，許 剛，何建軍

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院乳腺甲狀腺腫瘤外科，陜西西安 710061）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的身體健康和生活質(zhì)量。乳腺癌術(shù)后輔助化療可提高生存率、降低復(fù)發(fā)率和死亡率，而在化療方案中蒽環(huán)類藥物具有重要作用。用于乳腺癌化療的蒽環(huán)類藥物主要有多柔比星（阿霉素）、表柔比星和吡柔比星，且與其他化療藥物組成常用化療方案，如CAF方案（環(huán)磷酰胺＋多柔比星＋氟尿嘧啶）、CEF方案（環(huán)磷酰胺＋表柔比星＋氟尿嘧啶）、AC方案（環(huán)磷酰胺＋多柔比星）等。以上幾種化療方案雖然顯現(xiàn)出較好的臨床療效，但是臨床有效率仍不樂觀，僅達(dá)25%～30%［1-2］，這可能與化療藥物反應(yīng)率低或?qū)β?lián)合化療過程中產(chǎn)生的原發(fā)或繼發(fā)性耐藥有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，采用腫瘤組織樣本檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)的異常情況來預(yù)測(cè)化療藥物的敏感性和耐藥性是可行的［3-7］。TOP2ADNA（topoisomeraseⅡalpha）是常見的化療療效預(yù)測(cè)因子，該基因的表達(dá)水平與蒽環(huán)類藥物的關(guān)系已經(jīng)闡明［8-9］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TOP2A基因表達(dá)也受到腫瘤信號(hào)通路因子的調(diào)控［10］，但還沒有明確結(jié)論。本研究著重探討蒽環(huán)類藥物靶點(diǎn)TOP2A與HER2通路的關(guān)鍵因子的相關(guān)性，期望為進(jìn)一步探討蒽環(huán)類藥物的耐藥機(jī)制提供證據(jù)支持。

1 材料與方法

1．1 材料 收集2010～2013年在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院病理科行免疫組化檢查的96例浸潤(rùn)性乳腺癌（HER2蛋白表達(dá)1＋以上）手術(shù)組織標(biāo)本，所有病例均經(jīng)病理科確診，病理類型及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)核，所有患者都為女性，年齡29～71歲，中位年齡52歲。病理類型包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌80例，浸潤(rùn)性小葉癌9例，導(dǎo)管和小葉混合型癌7例。

1．2 樣本采集及檢測(cè)

1．2．1 樣本準(zhǔn)備 顯微鏡下對(duì)經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的腫瘤手術(shù)組織進(jìn)行腫瘤細(xì)胞含量分析，選擇1塊至少含70%腫瘤細(xì)胞的蠟塊進(jìn)行切片，刮取腫瘤組織送至廣州益善醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行檢測(cè)。

1．2．2 檢測(cè)方法 采用分支DNA液相芯片技術(shù)檢測(cè)TOP2A、HER2、PTEN基因mRNA表達(dá)，具體步驟如下：①取適量FFPE樣本加入裂解液，56℃下裂解反應(yīng)2h；②預(yù)雜交：將樣本裂解液轉(zhuǎn)至孵育板上，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，55℃震蕩孵育過夜；③吸取上清：次日將孵育板放在磁力架上1min，此時(shí)磁性微球聚集在底部，吸取棄去上清；④洗滌：加入洗滌液，震蕩洗滌1min，孵育板放在磁力架上1min，吸取棄去上清；重復(fù)3次；⑤雜交：加入擴(kuò)增延伸探針和標(biāo)記探針，50℃震蕩反應(yīng)1h；⑥洗滌：孵育板放在磁力架上1min，吸取棄去上清，用洗滌液洗2次；⑦信號(hào)放大：加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，50℃震蕩反應(yīng)30min；⑧洗滌：孵育板放在磁力架上1min，吸取棄去上清，用洗滌液洗2次；⑨讀數(shù)：加入洗滌液，震蕩5min，于Lu minex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)；⑩分析：數(shù)據(jù)分析，得出檢測(cè)結(jié)果。

采用xTAG液相芯片技術(shù)檢測(cè)PI3K突變，該技術(shù)步驟可分為微球編碼、探針偶聯(lián)、液相懸浮反應(yīng)和檢測(cè)分析。通過多重PCR方法獲得各基因外顯子上含有常見等位基因型的基因片段，然后進(jìn)行等位基因特 異 引 物 延 伸 （allele specificprimer extension，ASPE）反應(yīng)，ASPE引物上的Tag（微球）序列與聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特異結(jié)合，完成雜交反應(yīng)，雜交后的微球通過Luminex 200系統(tǒng)進(jìn)行分析，讀取每個(gè)樣品的中位熒光值（MFI）。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用W 檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料的正態(tài)性進(jìn)行考察，并根據(jù)正態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果選用Spearman秩相關(guān)法進(jìn)行雙變量之間的相關(guān)性分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件包上完成，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0．05。

2 結(jié) 果

2．1 患者的臨床基線特征 96例乳腺癌患者的臨床基線特征描述見表1。

2．2 TOP2A、HER2、PTEN mRNA的表達(dá)情況 采用分支DNA-液相芯片技術(shù)檢測(cè)TOP2A、HER2、PTEN基因的mRNA表達(dá)，內(nèi)參基因?yàn)橐唤M基因（B2 M、TBP、TFRC）。該技術(shù)不同于定量 PCR 技術(shù)，無需RNA提取和PCR擴(kuò)增，最大限度減少人為操作誤差。96例乳腺癌組織標(biāo)本中TOP2A的平均表達(dá)水平為1．54（0．71～6．20），HER2的平均表達(dá)水平為0．94（0．72～2．40），PTEN 的平均表達(dá)為0．27（0．08～0．73）?；騧RNA表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)四分位法：＜25%是低表達(dá)，25%～75%是中表達(dá)，＞75%是高表達(dá)，同理中表達(dá)又分為中表達(dá)偏低、中表達(dá)和中表達(dá)偏高。液相芯片檢測(cè)基于高、中、低表達(dá)的數(shù)值是患者基因表達(dá)在中國(guó)乳腺癌人群中的分布情況，表明該患者在整個(gè)人群中處于怎樣的水平，基因表達(dá)譜見圖1。

2．3 PI3K基因突變結(jié)果 采用xTAG液相芯片技術(shù)對(duì)HER2通路關(guān)鍵因子PI3K進(jìn)行檢測(cè)，在96例乳腺癌組織樣本中，PI3K突變率為19．80%。

2．4 正態(tài)分布檢驗(yàn)及相關(guān)性分析 正態(tài)性是進(jìn)行Pearson關(guān)聯(lián)性分析的前提假設(shè)，若變量不滿足正態(tài)性就無法使用其進(jìn)行分析，但可用Spearman進(jìn)行相關(guān)分析。因而，本研究采用W 檢驗(yàn)、KS檢驗(yàn)和D檢驗(yàn)對(duì)相應(yīng)變量TOP2A進(jìn)行正態(tài)性考察，發(fā)現(xiàn)本研究中的TOP2A的所有正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果均不滿足P大于0．10的條件，故可認(rèn)為TOP2A不服從正態(tài)分布，因此本研究采用Spearman相關(guān)進(jìn)行分析。

表1 96例患者的信息與臨床基線特征Tab．1 Information and clinical baseline characteristics of the 96patients

圖1 基因表達(dá)結(jié)果分析Fig．1 Results of gene expressions

2．5 TOP2A及HER2通路關(guān)鍵因子與臨床特征的相關(guān)性 結(jié)果顯示，TOP2AmRNA表達(dá)水平與性別、年齡、分期、腋窩淋巴結(jié)個(gè)數(shù)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等病理特征沒有明顯差異。HER2mRNA表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PTEN mRNA表達(dá)及PI3K基因突變與病理特征沒有明顯差異（表2）。

表2 基因狀態(tài)與臨床病理特征的相關(guān)性Tab．2 Correlation between gene state and clinicopathologic characteristics

2．6 TOP2A與HER2通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性分析 采用Spearman方法分析TOP2AmRNA表達(dá)與HER2、PTEN mRNA表達(dá)水平之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，TOP2A與HER2存在共表達(dá)性，HER2基因高表達(dá)時(shí)，TOP2A趨向于高表達(dá)（P＝0．01）；PTEN 表達(dá)與TOP2A表達(dá)無顯著差異性關(guān)系。通過分析TOP2A與HER2通路關(guān)鍵因子PI3K的相互關(guān)系，結(jié)果顯示，PI3K突變與TOP2A表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系，PI3K突變時(shí)TOP2A趨向于高表達(dá)（P＝0．004，表3）。

表3 基因表達(dá)的相關(guān)性分析Tab．3 Genetic correlation analysis

3 討 論

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和藥物基因組學(xué)研究的不斷深入，分子標(biāo)志物指導(dǎo)的乳腺癌個(gè)體化治療已成趨勢(shì)。利用患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行體外基因檢測(cè)，從而識(shí)別患者的個(gè)體基因特征，針對(duì)患者的個(gè)體遺傳差異來制定針對(duì)性的治療方案，不僅可以避免不當(dāng)治療或無效治療，提高治療針對(duì)性和有效率，而且可以提高患者生活質(zhì)量，提高用藥依從性，甚至可以減輕患者用藥成本。而識(shí)別患者個(gè)體化基因差異主要通過檢測(cè)特定基因的表達(dá)水平或突變來實(shí)現(xiàn)。

多項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TOP2A）、微管蛋白β-Ⅲ（TUBB3）、胸苷酸合成酶（TYMS）與乳腺癌的化療療效密切相關(guān)［10-12］，人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）、磷脂酶及張力蛋白同源物（PTEN）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）與乳腺癌靶向藥曲妥珠單抗療效直接相關(guān)［13-15］，且對(duì)乳腺癌化療療效有一定的影響。本文主要研究蒽環(huán)類藥物靶點(diǎn)TOP2A及其與HER2通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性，以探討蒽環(huán)類化療方案耐藥的可能影響因素。

TOP2A是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的一個(gè)亞基，是蒽環(huán)類藥物的主要作用靶點(diǎn)，其編碼基因位于第17號(hào)染色體，是DNA復(fù)制的關(guān)鍵酶，在DNA合成、轉(zhuǎn)錄以及在染色體分離、濃縮等過程中發(fā)揮重要作用。該酶通過催化DNA雙鏈斷裂和再接，導(dǎo)致DNA超螺旋的松解，蒽環(huán)類藥物因此可趁機(jī)嵌入到該酶與DNA結(jié)合部位的雙鏈之間，從而干擾了DNA斷裂端的重新連接，使其無法修復(fù)，從而殺死腫瘤細(xì)胞。臨床上，TOP2A的變異有兩種表現(xiàn)形式，分別是TOP2A基因拷貝數(shù)（判斷擴(kuò)增與否）和TOP2AmRNA表達(dá)，且有推斷認(rèn)為TOP2A擴(kuò)增或TOP2A高表達(dá)能夠?yàn)檩飙h(huán)類藥物提供更多的作用靶點(diǎn)［16］；也有研究認(rèn)為TOP2AmRNA表達(dá)是乳腺癌重要的預(yù)后因子，較擴(kuò)增更能預(yù)測(cè)蒽環(huán)類藥物療效［10］，所以蒽環(huán)類藥物可有效抑制TOP2A過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞增殖。反之，靶點(diǎn)缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤對(duì)蒽環(huán)類藥物耐藥。這也得到了循證醫(yī)學(xué)的驗(yàn)證。BRASE等［10］研究報(bào)道TOP2AmRNA低表達(dá)的乳腺癌患者使用蒽環(huán)類藥物的耐藥率提高。

HER2信號(hào)通路異常是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，其中關(guān)鍵基因也是乳腺癌重要靶向藥療效預(yù)測(cè)因子。HER2過表達(dá)的患者使用曲妥珠單抗療效顯著［13］，然而發(fā)生PTEN缺失或PI3K突變的患者卻對(duì)曲妥珠單抗表現(xiàn)為耐藥［15］。這是因?yàn)橐陨详P(guān)鍵基因的異常導(dǎo)致了HER2下游信號(hào)的激活，盡管曲妥珠單抗有足夠的作用靶點(diǎn)，但無法管控下游信號(hào)的異常變化，也就起不到腫瘤細(xì)胞增殖的作用。隨著蒽環(huán)類藥物的廣泛使用及對(duì)其耐藥性關(guān)注度的逐漸提高，臨床發(fā)現(xiàn)HER2過表達(dá)的乳腺癌患者表現(xiàn)為蒽環(huán)類藥物敏感［17］，且有人認(rèn)為是因?yàn)門OP2A和HER2基因均位于第17號(hào)染色體，且位置很近，編碼區(qū)可能存在相互調(diào)控作用［5］。后來有很多研究都證明了HER2過表達(dá)也是蒽環(huán)類藥物藥效的重要預(yù)測(cè)因子［18］。

本研究主要分析了TOP2A與HER2通路關(guān)鍵因子的相關(guān)性，檢測(cè)mRNA采用的是分支DNA-液相芯片技術(shù)，檢測(cè)中無需進(jìn)行RNA的提取、純化、逆轉(zhuǎn)錄等操作，一方面大大避免了因這些操作造成的誤差，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性；另一方面，液相芯片技術(shù)采用探針多位點(diǎn)特異性配對(duì)、級(jí)聯(lián)信號(hào)放大的原理，與傳統(tǒng)的real-time PCR相比，可同時(shí)檢測(cè)30多個(gè)位點(diǎn)，且引入多個(gè)管家基因作對(duì)照，使得檢測(cè)結(jié)果更為可靠。檢測(cè)基因突變采用的是xTAG-液相芯片技術(shù)，該技術(shù)可高通量檢測(cè)70個(gè)以上的靶標(biāo)，與其他技術(shù)相比，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、量化可重復(fù)、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了多通路多靶標(biāo)、準(zhǔn)確可靠的腫瘤樣本臨床檢測(cè)應(yīng)用。

基于可靠的檢測(cè)技術(shù)，我們對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析。通過分析基因的表達(dá)和突變與臨床基線特征之間的關(guān)系，可能由于樣本量小，沒有發(fā)現(xiàn)基因與臨床特征之間的明顯差異。由于隨訪還在進(jìn)行，本文尚無法分析基因檢測(cè)結(jié)果與藥物療效的對(duì)應(yīng)關(guān)系。關(guān)于TOP2A與HER2關(guān)系的相關(guān)性研究很多，，但對(duì)于TOP2A與HER2信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)報(bào)道很少。本研究對(duì)TOP2AmRNA表達(dá)與HER2、PTEN mRNA表達(dá)和PI3K突變進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TOP2A與HER2存有共表達(dá)現(xiàn)象，這與以往報(bào)道具一致性；TOP2A與PTEN沒有顯著性相關(guān)；TOP2A mRNA表達(dá)與PI3K突變存有正相關(guān)關(guān)系，PI3K突變的患者趨向于TOP2A高表達(dá)。

基于以上結(jié)果和分析，本研究初步驗(yàn)證了HER2通路關(guān)鍵因子HER2、PTEN表達(dá)和PI3K突變?cè)谡{(diào)控蒽環(huán)類化療耐藥基因TOP2A表達(dá)上的作用，這為乳腺癌個(gè)體化治療提供了理論依據(jù)。同時(shí)也提示我們，在個(gè)體化治療用藥前，通過檢測(cè)多個(gè)藥物分子標(biāo)志物如TOP2A、HER2、PTEN、PI3K等可為蒽環(huán)類用藥方案的選擇提供更為系統(tǒng)的依據(jù)。此外，本研究也為進(jìn)一步探討蒽環(huán)類耐藥機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但還需大樣本臨床試驗(yàn)進(jìn)一步研究各基因之間的調(diào)控關(guān)系。

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