謝守嬪 ，羅 佳 ，李海龍 ，吳紅彥 △

1蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2蘭州市中醫(yī)醫(yī)院；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué);4甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室

當(dāng)歸是已廣泛使用的藥物，當(dāng)歸及其提取物在實(shí)驗(yàn)研究中也體現(xiàn)出對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有保護(hù)作用，但對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡卻未見報(bào)道。因而，本實(shí)驗(yàn)擬以Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞復(fù)制阿爾茨海默病細(xì)胞模型為對象，采用具有養(yǎng)血、活血、調(diào)肝的當(dāng)歸含藥血清以不同濃度加以干預(yù)，從細(xì)胞活力、細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞凋亡的變化入手，探索其藥理機(jī)制，為進(jìn)一步篩選當(dāng)歸有效組份提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 SPF級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(300±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(甘)2004-0006-0000994，實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證編號(hào)：SYXK(甘)2004-0006-0000308。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，食固體飼料，飼料由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，食水自由，室溫20～25℃，相對濕度45%～52%。PC12細(xì)胞(中分化)購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 中藥材當(dāng)歸：購于甘肅蘭州老字號(hào)“復(fù)興厚”藥材公司；DMEM：Sigma公司，批號(hào)：NVL0337。細(xì)胞培養(yǎng)液：將DMEM培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%雙抗，0.22μm濾器過濾除菌，PH 7.2～7.4，4℃保存。磷酸鹽緩沖液(PBS)：購于gibico公司，批號(hào)：20101025；用雙蒸水定容至1 000 mL，0.22μm濾器過濾除菌，PH為 7.2～7.4，4℃保存。Hanks：Solarbio，批號(hào)：H1025。胎牛血清：杭州四季青公司，批號(hào)：100528；56℃滅活30分鐘，無菌分裝，-20℃保存，使用前經(jīng)4℃、室溫、37℃緩慢溶解備用。胰蛋白酶：購于鵬程公司，批號(hào)：0458；用PBS液配制成濃度為0.25%溶液，0.22μm濾器過濾除菌，4℃保存。四氮唑藍(lán)(MTT)：購于鵬程生物工程公司，批號(hào)：0793；用pH為7.4的PBS溶解，用時(shí)配成終濃度5 mg/mL的溶液，4℃避光保存。二甲基亞砜(DMSO)：購于鵬程公司。LDH試劑盒：購于南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20101025。Aβ25-35：sigma公司，批號(hào)：108k4794。Anncxin V/PI試劑盒：杭州聯(lián)科生物公司，批號(hào)：JK100929。

1.3 Aβ配制方法 將1mg Aβ25-35溶解于BPS液中，配制成濃度為1mmol／L母液。儲(chǔ)存于-30℃冰箱中備用。使用時(shí)將其稀釋至100μmol/L，并置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中3～7天以增強(qiáng)其毒性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞株完全培養(yǎng)液為DMEM+10%(體積比)胎牛血清+青鏈霉素，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4天傳代1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組 正常組：只加細(xì)胞懸液，不加任何處理因素；模型組：取20μmol/L終濃度的A β25-3530μL處理細(xì)胞24小時(shí)；空白血清組：用空白血清組加入空白血清30μL預(yù)處理24小時(shí)后加入20μmol/L終濃度Aβ25-3530μL共同孵育24小時(shí)；藥物組：當(dāng)歸10倍(當(dāng)歸高劑量組)，5倍(當(dāng)歸中劑量組)，正常劑量(當(dāng)歸小劑量組)3組含藥血清30μL預(yù)處理24小時(shí)后加入20μmol/L終濃度Aβ25-3530μL共同孵育24小時(shí)。

1.6 MTT法測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，消化、離心后用完全培養(yǎng)液重懸，濃度為1×104μmol/mL，接種于96孔板，每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，細(xì)胞貼壁后，吸取舊的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)平行樣本，按上述分組處理后，各孔吸去上清液20μL，加濃度為 0.5mg/mLMTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，然后每孔加200μL二甲基亞楓，震蕩8分鐘，使紫色結(jié)晶充分溶解，空白孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測儀上測每孔吸光度即OD值(檢測波長570 nm)。

1.7 LDH測定 取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按照以1×105/孔的密度接種于96孔板，每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液90μL，每組設(shè)8個(gè)平行樣本，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后，按LDH試劑盒說明進(jìn)行標(biāo)本的測定。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)。LDN活性 =(ODu-ODc)/(ODs-ODb)×Cs×N×1000式中：ODu為測定管吸光度值、ODc空白管吸光度值、ODs為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值、ODb為對照管吸光度值、Cs為標(biāo)準(zhǔn)濃度(2mmol/L)、N為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 1)取對數(shù)生長期PC12細(xì)胞(1×105/孔)，接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組如前處理；2)處理后經(jīng)胰酶消化、吹打成單細(xì)胞懸液，移入離心管中；3)將離心管于1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗1次后，重復(fù)離心洗滌一次；4)依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作，將細(xì)胞重懸于500μL binding buf fer中，再分別加入5μL的AnnexinV-FITC溶液和10μLP1染液，避光于室溫放置5分鐘；5)轉(zhuǎn)至流式檢測管，上機(jī)檢測，實(shí)驗(yàn)同法重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用(χ±s)表示，采用單因素方差分析(F檢驗(yàn))，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 正常組PC12細(xì)胞生長速度快，貼壁良好，大多伸出長的軸突，容易成簇生長。在模型組中細(xì)胞明顯損傷，數(shù)量顯著減少，可見PC12細(xì)胞腫脹、圓縮，突起回縮，貼壁功能下降，有脫壁漂浮現(xiàn)象。

2.2 MTT檢測結(jié)果 MTT法測定各實(shí)驗(yàn)組的OD值顯示，模型組所測的OD值為(0.64±0.40)，空白血清組(0.78±0.14)，2組沒有差異；空白組的OD值為 (1.35±0.27)，與模型組比較有顯著性差(P＜0.01)，顯示造模成功；當(dāng)歸小、中、大3個(gè)劑量組OD值均比模型升高，其中高劑量組與小劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 當(dāng)歸大鼠含藥血清對Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞的OD值和LDH活性的影響(χ±s)

2.3 LDH檢測結(jié)果 測定各實(shí)驗(yàn)組LDH的OD值顯示，模型組所測的OD值為(875.5±102.27)，空白血清組(832.72±186.5)，2組沒有差異；空白組的OD值為(438.47±99.84)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，顯示造模成功；當(dāng)歸小、中、大3個(gè)劑量組OD值均比模型升高，其中高劑量組與小劑量組比較有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，中劑量組與小劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 與模型組比較，空白組有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，顯示造模成功；當(dāng)歸小、中、大3個(gè)劑量組細(xì)胞活力均比模型升高，各當(dāng)歸組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與當(dāng)歸小劑量組與大劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2和附圖1-6。

表2 當(dāng)歸大鼠含藥血清對Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞活力和凋亡率的影響(χ±s)

圖1 -6 當(dāng)歸大鼠含藥血清對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

當(dāng)歸性味甘、辛、苦而溫，入肝、心、脾經(jīng)。《本草》云：“當(dāng)歸，治一切氣，補(bǔ)一切血，破惡血，養(yǎng)心血。”《景岳全書·本草正》載：“當(dāng)歸，其味甘而重，故專能補(bǔ)血；其氣輕而辛，故又能行血。補(bǔ)中有動(dòng)，行中有補(bǔ)，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也?！笨梢姰?dāng)歸既可益陰血而補(bǔ)肝體，養(yǎng)血安神，又可舒肝氣而助肝用，調(diào)氣機(jī)而暢情志，氣血同調(diào)，心肝并治，對老年性癡呆精神與行為失常的防治具有很好的理論針對性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Aβ25-35誘導(dǎo)的作用下，PC12細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡，當(dāng)歸各含藥血清能升高PC12細(xì)胞的活力，降低 LDH釋放，對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用。有報(bào)道，采用大劑量當(dāng)歸治療腦中風(fēng)后遺癥，其不僅能改善后遺癥，且能明顯改善中風(fēng)患者出現(xiàn)的記憶力減退等認(rèn)知功能障礙，并未見明顯副作用［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，當(dāng)歸可清除體內(nèi)氧自由基，抗脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，具有明顯的抗衰老功能［2-11］；當(dāng)歸能降低血管性認(rèn)知障礙大鼠腦組織中AChE含量，升高其血中SS含量，體現(xiàn)出對中樞膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)活性和數(shù)量的調(diào)節(jié)作用［12］；當(dāng)歸提取物可劑量依賴性地減弱Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和tau蛋白磷酸化，同時(shí)，它能增加Akt的絲氨酸磷酸化水平，并下調(diào)GSK-3β活性，說明當(dāng)歸提取物保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用與PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)［13］；當(dāng)歸根的乙醇提取物對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性有保護(hù)作用，并能升高線粒體跨膜電位Del taPsim［14］。關(guān)于當(dāng)歸抗凋亡的保護(hù)作用，仍有待進(jìn)一步深入研究。

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