羅文哲 ，王建杰， 呂冬霞

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

毛尖蘑粗多糖對H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表達的影響①

羅文哲 ，王建杰， 呂冬霞

(佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：研究毛尖蘑粗多糖對H22肝癌小鼠 TNF-α和IL-2表達的影響。方法：建立小鼠肝癌模型，并隨機分為4組：陰性對照組、陽性對照組、毛尖蘑粗多糖低(20mg/mL)、高劑量組(40mg/mL)，每組10只。于接種后24h給予不同處理，每日1次，腹腔注射。14d后，采用ELISA法測定血清中TNF-α與IL-2水平，RT-PCR對外周血單個核細胞(PBMC)TNF-α與IL-2 mRNA表達進行檢測。結(jié)果:模型對照組血清中IL-2 水平低于正常對照組(P<0.05)，TNF-α水平變化不明顯，毛尖蘑粗多糖組TNF-α和IL-2水平高于模型對照組(P<0.05)。PBMC中TNF-α和IL-2mRNA在毛尖蘑粗多糖組高于模型對照組(P<0.05)。結(jié)論：毛尖蘑粗多糖能促進TNF-α和IL-2 分泌而發(fā)揮了抗腫瘤作用。

毛尖蘑粗多糖；肝癌；細胞因子

毛尖蘑，別名金子蘑，是一種罕見的野生珍稀食用真菌。在前期研究工作中，我們對毛尖蘑中的粗多糖進行了提取，并發(fā)現(xiàn)其對H22荷瘤小鼠的腫瘤生長有抑制作用[1,2]，但對免疫功能的影響尚未見報道。因此，本研究通過建立小鼠H22肝癌模型，采用ELISA、RT-PCR方法，對荷瘤小鼠外周血中TNF-α與IL-2水平、以及相應(yīng)的mRNA進行了檢測，以闡明毛尖蘑粗多糖如何影響H22肝癌小鼠的免疫功能，為毛尖蘑粗多糖的抗腫瘤作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

毛尖蘑子實體購于大興安嶺呼瑪縣韓家園林業(yè)局松濤鹿苑公司。環(huán)磷酰胺(CTX)為上海華氏制藥有限公司天平制藥廠產(chǎn)品。紅細胞裂解液、淋巴細胞分離液購于上海新睿生物科技有限公司。TNF-α、IL-2酶聯(lián)免疫雙抗體夾心(ELISA)試劑盒購于深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司。總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒購于Promega生物公司。Trizol試劑購于Invitrogen公司。β-actin多克隆抗體來自北京北京康為世紀生物科技有限公司。昆明種小鼠雌性為佳木斯大學實驗動物中心提供。小鼠H22肝癌細胞株為哈爾濱醫(yī)科大學腫瘤研究所惠贈。

1.2 方法

1.2.1 毛尖蘑粗多糖提取

根據(jù)文獻報道，采用熱水浸提方法改良[1]。

1.2.2 建立小鼠肝癌模型以及藥物處理

將小鼠腹水瘤以生理鹽水制成腫瘤細胞懸液，濃度5×106個/mL，注于小鼠右前肢腋下0.2mL/只，制作荷瘤鼠模型，共40只。24h后，將小鼠隨機分成4組，每組以不同的處理因素進行干預，一組為腫瘤對照組(對照組)：無任何干預；一組為陽性藥物對照組(CTX組)：給予CTX，25mg/kg·d，每日1次，腹腔注射；其他兩組為毛尖蘑粗多糖低劑量、高劑量組：低劑量組給予毛尖蘑粗多糖20mg/mL，高劑量給予40mg/mL，腹腔注射，每日1次，連續(xù)14d。每日觀察，隔日稱重。

1.2.3 檢測荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2的水平

各組小鼠14d后，外周血采血，4 ℃、3,000r/min離心10min，吸取血清，ELISA法檢測各組小鼠血清中TNF-α和IL-2的水平，實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.2.4RT-PCR檢測TNF-α、IL-2mRNA的表達

應(yīng)用淋巴細胞分離液分離小鼠的外周血中的PBMC，調(diào)整細胞濃度至2×106個細胞/mL，于24孔細胞培養(yǎng)板中各加0.5mL的細胞懸液，在培養(yǎng)箱中(5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)48h。加入Trizol，按照說明書提取細胞的總RNA。應(yīng)用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，PCR擴增，25μL為總反應(yīng)體積。TNF-α引物序列(460bp)：上游：5’-TGGCCCAGACCCTCACA-3’，下游：5’-TGCCCGGACTCCGTGAT-3’；IL-2引物序列(502bp)：上游: 5`-ATGTACAGCATGCAGCTCGCATC-3`，下游: 5`-GGCTTGTTGAGATGATGCTTTGACA-3`；β-actin序列：上游: 5`-ATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3`，下游: 5`-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3`。TNF-α的反應(yīng)條件為94 ℃變性30s，55 ℃退火30s, 72 ℃延伸30s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸5min。4 ℃終止。IL-2的反應(yīng)條件為94 ℃變性30s，57 ℃退火45s，72 ℃延伸30s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸7min。4 ℃終止。內(nèi)參為β-actin。應(yīng)用圖像灰度掃描系統(tǒng)進行灰度值測定，計算與β-actin比值，得到mRNA相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 毛尖蘑粗多糖的提取

用苯酚-硫酸法測定了毛尖蘑子實體中提取的固形物中多糖的含量為97.5%。

2.2 血清中IL-2 和 TNF-α的變化

IL-2 水平在模型組低于正常組(P<0.05)，TNF-α無明顯變化，毛尖蘑粗多糖組IL-2 和TNF-α較模型組明顯增加(P<0.05)。

表1 毛尖蘑粗多糖對小鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響

注：與模型比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05。

2.3 TNF-α 和IL-2 mRNA的表達

如表2、圖1顯示，IL-2、TNF-α的PCR結(jié)果在502bp和460bp處出現(xiàn)條帶，條帶灰度值經(jīng)掃描分析，差異具有顯著性(P<0.01)。

圖1PBMC中IL-2、TNF-αmRNA表達

表2 毛尖蘑粗多糖對PBMC IL-2、TNF-αmRNA表達的影響

注：與模型對照組比較，**P<0.01

3 討論

研究顯示，TNF-α與IL-2是免疫系統(tǒng)中起重要作用的調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)T、B細胞的增殖、分化等免疫功能，并參與各種免疫反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)。腫瘤免疫中，TNF-α與IL-2二者協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。經(jīng)過炎癥介質(zhì)、內(nèi)毒素、白細胞介素-1等物質(zhì)的刺激，單核/巨噬細胞活化，活化后主要分泌腫瘤壞死因子，它是一種小分子蛋白質(zhì)。根據(jù)不同的基因結(jié)構(gòu)及功能, 腫瘤壞死因子分為TNF-α、TNF-β兩種。單核/巨噬細胞主要分泌的是TNF-α, 而TNF-β主要由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生。TNF-α具有直接的抗腫瘤作用，以自分泌的方式作用于分泌的細胞，在病變部位產(chǎn)生，并集中于局部區(qū)域，具有選擇性，被認為是一種多功能的細胞因子[4]。IL-2為T細胞生長因子，對T細胞的活化、增殖具有促進作用，是重要的可溶性因子，也是細胞因子網(wǎng)絡(luò)性調(diào)節(jié)的核心，對細胞免疫、體液免疫以及非特異性免疫功能具有重要意義。目前，國內(nèi)外文獻報道顯示, 晚期腫瘤患者或者荷瘤動物體內(nèi)IL-2產(chǎn)生的含量明顯比正常人低，同時，IL-2 活性也明顯低于正常人, 這可能是癌癥晚期患者或者荷瘤動物誘生了某些抑制性的細胞群，這些細胞群產(chǎn)生了免疫抑制因子，非特異性抑制了IL-2產(chǎn)生與活性，或者因為IL-1等這些IL-2生成必需的淋巴因子活性減弱引起[5]。 毛尖蘑是黑龍江省特有的食、藥用真菌，天然綠色食品。其多糖具有抗腫瘤，保肝護肝，增強免疫力等作用[2]。對此，我們進一步研究了毛尖蘑粗多糖組對TNF-α和IL-2的影響，經(jīng)過實驗證明，荷瘤小鼠在灌胃2周后，TNF-α和IL-2水平明顯升高，mRNA表達增強。由此，我們可以認為，毛尖蘑粗多糖促進免疫細胞分泌TNF-α和IL-2，這是通過促進了外周血單個核細胞的TNF-α和IL-2mRNA的轉(zhuǎn)錄。毛尖蘑粗多糖能通過調(diào)節(jié)TNF-α和IL-2分泌發(fā)揮了抗腫瘤作用。

[1]范曉艷，呂冬霞，劉爽，等. 毛尖蘑粗多糖提取方法的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2010，33(4): 20-21

[2]呂冬霞,范曉艷,金岳雷,等. 毛尖蘑子實體粗多糖對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用[J].中國老年學雜志,2012,32(11):2303-2304

[3]MargolinKA.Interleukin-2inthetreatmentofrenalcancer[J]．SeminOncol，2000，27(2):194-203

[4]孫云暉,代立娟. 肺癌中PPAR-和TNF-的表達及臨床意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2008,31(1):12-13

[5]王麗娟,孫蕾,王振東.葛根素對U14宮頸癌小鼠免疫和氧化功能的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學,2011,34(4):42-43

佳木斯大學校級重點項目，編號：Sz2013-002。

羅文哲(1976～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生，副教授。

呂冬霞(1965～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，碩士研究生導師。E-mail: luo228071luo@163.com

R737.9

A

1008-0104(2015)04-0037-02

2014-12-22)