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hFAM92A1在人宮頸癌細(xì)胞不同周期時(shí)相的表達(dá)*

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-03-19網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150319.0926.001.html

方娟1, 王珺1, 龔堅(jiān)1, 王燕1, 阮緒芝2**

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 湖北 十堰442000； 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 科技處， 湖北 十堰442000)

[摘要]目的： 探討hFAM92A1在人宮頸癌HeLa細(xì)胞不同周期時(shí)相的表達(dá)差異。方法： 常規(guī)培養(yǎng)Hela細(xì)胞，應(yīng)用血清饑餓法將HeLa細(xì)胞同步化于G1期，胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步化于S、G2期，秋水仙素阻斷法同步化于M期，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)同步化效率，應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)hFAM92A1在人宮頸癌HeLa細(xì)胞不同周期時(shí)相的表達(dá)水平。結(jié)果： 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞同步化效率G1期為77.5%、S期為85.5%、G2期為61.9%、M期為44%；FAM92A1基因在各期均有表達(dá)，但存在差異，以S期表達(dá)最高。結(jié)論： FAM92A1基因在HeLa細(xì)胞不同周期時(shí)相的表達(dá)有較大差異。

[關(guān)鍵詞]基因； 子宮頸； 癌； 細(xì)胞周期

細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂的整個(gè)連續(xù)的過(guò)程。細(xì)胞周期的運(yùn)行受多個(gè)因素的影響，有2個(gè)調(diào)控點(diǎn)，一個(gè)是G1/S期轉(zhuǎn)折點(diǎn)，另一個(gè)是G2/M期轉(zhuǎn)折點(diǎn)，細(xì)胞周期失控運(yùn)行將導(dǎo)致癌的發(fā)生。因此，增殖相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控中的作用研究是認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生機(jī)制的重要內(nèi)容。FAM92A1基因是在前期研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)位于細(xì)胞核的基因[1-2]，在人多種正常組織和癌組織中廣泛表達(dá)，可能參與細(xì)胞周期調(diào)控。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)異常是癌癥研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[4-8]。已有文獻(xiàn)報(bào)道宮頸癌有細(xì)胞周期失控現(xiàn)象存在。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究hFAM92A1在人宮頸癌HeLa細(xì)胞不同周期時(shí)相的表達(dá)差異，為研究hFAM92A1基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料和儀器

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株由本室保存，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，胸腺嘧啶核苷、秋水仙素購(gòu)自Sigma公司, Trizol購(gòu)自Invitrogin, RT-PCR引物由上海生工合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物科技發(fā)展有限公司。所需儀器有CO2培養(yǎng)箱、低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、倒置顯微鏡(萊卡)、PCR儀(Eppendorf)、熒光定量PCR儀(ABI)，流式細(xì)胞儀(FAC Scalibur)，紫外分光光度儀(UV-3802)。

1.2　HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及同步化

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度90%時(shí)，接種到6孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。G1期細(xì)胞同步化采用血清饑餓的方法，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，換成無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)42 h后收集G1期細(xì)胞。S期細(xì)胞同步化采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí),加入含終濃度為2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 h，再加入含終濃度為2 mmol/L胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2遍，換成10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h收集S期細(xì)胞；G2細(xì)胞同步化采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，在第二次阻斷釋放后培養(yǎng)9 h收集G2期細(xì)胞。M期細(xì)胞同步化采用秋水仙素阻斷法，細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)，換成秋水仙素終濃度為1 mg/L的培養(yǎng)基,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 h后收集M期細(xì)胞。

1.3　細(xì)胞周期同步化效率檢測(cè)

收集到的各期細(xì)胞加75%的冰乙醇5 mL 4 ℃固定過(guò)夜，1 000 r/min離心5 min棄上清，加PBS洗滌,1 000 r/min離心5 min，棄上清，加100 μL RNaseA 37 ℃水浴30 min，加400 μL碘化丙定(PI)染色混勻，4 ℃避光30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)同步化效率。

1.4　細(xì)胞總RNA的提取

收集到的各期細(xì)胞分別加500 μL Trizol液充分裂解細(xì)胞，收集到無(wú)RNA酶的EP管中，加入100 μL氯仿，室溫靜置3 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,吸取上清，加入等體積的異丙醇，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入預(yù)冷75%乙醇800 μL，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清，干燥5 min，加入無(wú)RNA酶水20 μL，取1 μL RNA，按照1∶50的比例稀釋后用紫外分光光度儀檢測(cè)A260和A280的值，對(duì)總的RNA濃度進(jìn)行定量分析，余下的放-80 ℃保存。

1.5　RT-PCR

收集同步化的各個(gè)周期時(shí)相的細(xì)胞，以不做任何處理HeLa細(xì)胞為對(duì)照，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)HeLa細(xì)胞中FAM92A1的表達(dá)。按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作，取1 000 ngRNA為模板，總體積為20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件，70 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，-20 ℃保存；RT-PCR，將上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍后取2 μL為模板，反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s，55 ℃ 22 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 5 min，36循環(huán)，用瓊脂糖凝膠方法分析。

2結(jié)果

2.1　總RNA純度

外分光光度儀檢測(cè)吸光度結(jié)果，G1期A260值為0.245,A260/A280比值為 1.91;S 期A260值為0.320,A260/A280比值為2.01;G2 期A260值為0.224,A260/A280比值為1.95;M期A260值為0.106,A260/A280比值為1.96。電泳結(jié)果清晰顯示5 S、18 S、28 S三個(gè)條帶，且18 S和28 S的灰度比為1∶2，表明所提RNA純度很高，能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)要求。見圖1。

注：DL2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物大小為2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp，Hela細(xì)胞1-5分別為正常，G1、S、G2、M各時(shí)相圖1　Hela細(xì)胞總RNA電泳圖Fig.1　Electrophoresis of total RNA of HeLa cells in each phase

2.2　HeLa細(xì)胞同步化效率檢測(cè)

HeLa細(xì)胞各期同步化后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，G1期同步化效率為 77.5%，S期同步化效率為 85.5%，G2期同步化效率 61.9%，M 期同步化效率為44%。

2.3　FAM92A1表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示FAM92A1的表達(dá)隨細(xì)胞周期時(shí)相的變化而存在差異，以S期表達(dá)量最高(如圖2)。

1~5為對(duì)照、M期、G2期、S期及G1期HeLa細(xì)胞中FAM92A1的表達(dá)， 6~10為對(duì)照、M期、G2期、S期及G1期HeLa細(xì)胞中GAPDH內(nèi)參的表達(dá)圖2　HeLa細(xì)胞不同周期時(shí)相FAM92A1基因的表達(dá)Fig.2　FAM92A1 gene expression of HeLa cells in different phases

3討論

FAM92A1基因是近期發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，與細(xì)胞增殖關(guān)系密切，在正常生長(zhǎng)旺盛的組織和腫瘤組織中高度表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)控[10]，但是其生物學(xué)功能目前尚不明確。

細(xì)胞正常的分裂、增殖、分化與衰老維持著機(jī)體的穩(wěn)定，細(xì)胞周期的異常會(huì)導(dǎo)致這一過(guò)程的紊亂。許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素及癌基因產(chǎn)物對(duì)DNA代謝的調(diào)節(jié)都是通過(guò)影響細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的，許多基因的表達(dá)又受到細(xì)胞周期的制約。調(diào)控細(xì)胞周期的核心因子就是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK，cyclin dependent kinase)，它與不同的細(xì)胞周期蛋白形成多種復(fù)合物，作用于細(xì)胞周期的不同時(shí)相，決定著細(xì)胞周期的進(jìn)程。而近幾年來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的多種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(CKI，cyclin dependent kinase inhibitor)，更加深了對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的了解。

基因突變或基因表達(dá)異常是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。為了深入研究FAM92A1基因的生物學(xué)功能，本研究從細(xì)胞周期入手，首先通過(guò)細(xì)胞同步化方法，將細(xì)胞同步化于G1,S,G2,M期，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)同步化效率，接著運(yùn)用RT-PCR證實(shí)FAM92A1在HeLa細(xì)胞各個(gè)時(shí)相均有表達(dá)，以S期表達(dá)量最高，G1,G2,M期表達(dá)較低，這種各時(shí)相表達(dá)的差異性可能與FAM92A1在細(xì)胞周期中所起的調(diào)控作用關(guān)系密切。又知S期細(xì)胞的主要活動(dòng)是進(jìn)行DNA復(fù)制，DNA復(fù)制完成與否直接影響細(xì)胞增殖周期的運(yùn)行，hFAM92A1基因過(guò)表達(dá)時(shí)發(fā)生S期阻滯，提示其與DNA復(fù)制有關(guān)。那么FAM92A1基因在其它腫瘤細(xì)胞各時(shí)相的表達(dá)及其具體的生物學(xué)功能又是怎么樣的？有待于進(jìn)一步的研究。

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(2014-12-06收稿，2015-02-21修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 趙毅

Expression of hFAM92A1 in Different Cell Cycle Time Phases

of Human Cervical Carcinoma HeLa Cells

FANG Juan1, WANG Jun1, GONG Jian1, WANG Yan1, RUAN Xuzhi2

(InstituteofBasicMedicine,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000,Hubei,China; 2.DivisionofScienceand

Technology,HubeiMedicalCollege,Shiyan442000,Hubei,China)

[Abstract]Objective: To investigate the expression differences of hFAM92A1 in different cell cycle time phases of HeLa cells of human cervical carcinoma. Methods: HeLa cells were conventionally cultured and synchronized in G1 phase using serum starvation, synchronized in G2 and S phase using double thymidine blocking, synchronized in M phase using colchicine blocking, and synchronizing efficiency was tested by flow cytometry. RT-PCR method was adopted to detect the expression of hFAM92A1 in different cell cycle phases of HeLa cells. Results: Flow cytometry instrument detected cell synchronization efficiency as follows： G1 phase 77.5%, S phase 85.5%,G2 phase 61.9%，M phase 44%. FAM92A1 genes were expressed in each period but with differences, the highest expression was in S phase. Conclusions: FAM92A1 gene of HeLa cell expression in different cycle phases exhibit notable differences.

[Key words]genes; cervix uteri; carcinoma; cell cycle

[中圖分類號(hào)]R737.33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2015)03-0304-03

通信作者**E-mail:ranxuzhi@163.com

[基金項(xiàng)目]*湖北醫(yī)藥學(xué)院碩士啟動(dòng)金項(xiàng)目(No：2012ZRQDJ09)