呂欣，宋冬梅，王寶山，2(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊05003;2河北醫(yī)科大學(xué))

人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞血紅素加氧酶1表達(dá)及其對(duì)卡鉑作用的影響

呂欣1，宋冬梅1，王寶山1，2
(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031;2河北醫(yī)科大學(xué))

摘要:目的探討人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞血紅素加氧酶1(HO-1)表達(dá)對(duì)卡鉑作用的影響及其可能的作用機(jī)制。方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞分為六組。空白對(duì)照組不干預(yù)，ZnPP(HO-1抑制劑鋅原卟啉)組加入ZnPP 10 μmol/L; Hemin(HO-1誘導(dǎo)劑氯化血紅素)組加入Hemin 10 μmol/L;卡鉑組加入卡鉑10 μg/mL; Hemin聯(lián)合卡鉑組先加入Hemin 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL; ZnPP聯(lián)合卡鉑組先加入ZnPP 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加藥后培養(yǎng)24 h。采用MTT法觀察各組細(xì)胞存活率; RT-PCR、Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)HO-1mRNA和蛋白表達(dá)情況;dCFH-DA探針檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果①細(xì)胞存活率:與空白對(duì)照組比較，卡鉑組和ZnPP組明顯降低，Hemin組明顯升高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯(lián)合卡鉑組明顯降低，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯升高(P均＜0.05)。②細(xì)胞HO-1mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量:與空白對(duì)照組比較，卡鉑組和Hemin組明顯升高，ZnPP組明顯下降(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯(lián)合卡鉑組明顯降低，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯升高(P均＜0.05)。③細(xì)胞凋亡率:與空白對(duì)照組比較，卡鉑組、ZnPP組明顯升高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯(lián)合卡鉑組明顯升高，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯降低(P均＜0.05);④細(xì)胞內(nèi)ROS活性:與空白對(duì)照組比較，卡鉑組、ZnPP組顯著增高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯(lián)合卡鉑組明顯升高，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯降低(P均＜0.05)。結(jié)論HO-1在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)可影響卡鉑對(duì)Hep-2細(xì)胞的促凋亡作用，應(yīng)用ZnPP后HO-1表達(dá)下調(diào)，同時(shí)提高了人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞在卡鉑作用下的凋亡率，這一過程可能與增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平相關(guān)。

關(guān)鍵詞:喉鱗癌;血紅素加氧酶1; Hep-2細(xì)胞;卡鉑;細(xì)胞凋亡

HO-1 expression in human laryngeal squamous-cell carcinoma Hep-2 cells and its influence on Carboplatin’s effects

LYU Xin1，SONGdong-mei，WANG Bao-shan
(1 The First Hospital of Hebeimedical University，Shijiazhuang 050031，China)

Abstract:Objective To investigate the influence of heme oxygenase-1(HO-1)expression in human laryngeal squamous-cell carcinoma Hep-2 cells on the Carboplatin’s effects and its possiblemechanism.Methods Hep-2 cells in the logarithmic phase weredivided into six groups.The blank control group was not treated，ZnPP group was treated with 10 μmol/L HO-1 inhibitor，Hemin group was treated with 10 μmol/L HO-1 inducer，and Carboplatin group was treated with 10 μg/mL，Hemin combined with Carboplatin group was treated with 10 μmol/L Hemin alone for 1 h and then 10 μg/mL Carboplatin，ZnPP combined with Carboplatin group was treated with 10 μmol/L ZnPP alone for 1 h and then 10 μg/mL Carboplatin.These six groups all had five complex holes and were cultured for 24 h afterdosing.The survival rates were evaluated bymTT assay.The expression of HO-1mRNA and protein wasdetected by RT-PCR and Western blotting.Intracellular ROS activity was examined bydCFH-DA probe.The apoptosis rate was performed by flow cytometry.Results①the cell survival rate: compared with the control group，the survival rates of Hep-2 cells in the ZnPP and Carboplatin groups were significantlydecreased，but the survival rate in the Hemin group was increased(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，the survival rate of the Znpp combined with Carboplatin group wasdecreased and the He-

min combined with Carboplatin group was increased(all P＜0.05).②HO-1 inmRNA and protein levels: compared with the control group，the expression of HO-1mRNA and protein was increased in the Hemin and Carboplatin groups and wasdecreased in the ZnPP group(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，the Znpp combined with Carboplatindecreased，but HO-1 expression was increased in the Hemin combined with Carboplatin group(all P＜0.05).③the apoptosis rate: compared with the control group，the apoptosis rates in the Carboplatin and ZnPP groups were increased(all P ＜0.05); compared with the Carboplatin group，Znpp combined with Carboplatin increased the apoptosis rate，but Hemin combined with Carboplatindecreased the apoptosis rate(all P＜0.05).④the ROS activity: compared with the control group，the the ROS activities in the Carboplatin and ZnPP groups were increased(all P＜0.05); compared with the Carboplatin group，Znpp combined with Carboplatin increased the ROS activity，but Hemin combined with Carboplatindecreased the ROS activity(all P＜0.05).Conclusions HO-1 overexpressionmay affect the pro-apoptotic effects of Carboplatin on Hep-2 cells，and the application of ZnPPdown-regulates the HO-1 expression and increases the apoptosis rate of Hep-2 cells with treatment of Carboplatin.In this process，the elevation of intracellular ROS activitymay be involved.

Key words:laryngeal squamous-cell carcinoma; heme oxygenase-1; Hep-2 cells; Carboplatin; apoptosis

血紅素氧合酶1(HO-1)屬于微粒體催化酶類，是降解血紅素重要的限速酶之一，其可將血紅素分解為一氧化碳、Fe2 +、膽綠素等［1～3］。HO-1是一種細(xì)胞保護(hù)性酶，具有抗炎、抗氧化及抑制細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)作用;但近年來研究發(fā)現(xiàn)，HO-1的這一細(xì)胞保護(hù)作用及抗凋亡特性可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及產(chǎn)生治療抵抗的重要因素［4～6］，但具體機(jī)制不清。目前，HO-1在頭頸部腫瘤尤其是喉鱗癌中的作用鮮見報(bào)道。2014年11月～2015年5月，我們觀察了HO-1誘導(dǎo)劑氯化高鐵血紅素(Hemin)和HO-1抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)對(duì)人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)的影響及HO-1表達(dá)對(duì)卡鉑作用的影響，分析HO-1與喉鱗癌化療抵抗的關(guān)系，為喉鱗癌的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞株(以下稱Hep-2細(xì)胞)本實(shí)驗(yàn)室凍存。DMEM/F12購(gòu)自Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司; Hemin購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Lot NO.51280); ZnPP購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司(SC-200329);卡鉑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H10920028);二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Lot NO.D-5879);四甲基噻唑基四唑(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Lot NO.M2128);碘化丙啶(PI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(Lot NO.P4170); HO-1及內(nèi)參GAPDH引物由上海生工合成;兔抗人HO-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司(ab13243);內(nèi)參β-actin購(gòu)自北京博奧森試劑公司(bs-0061R);活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所(S0033); RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司(K1611，K1081)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)將Hep-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。以0.25%胰酶消化傳代，2～3d傳代1次，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將Hep-2細(xì)胞胰酶消化后，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁12 h后分為六組?？瞻讓?duì)照組不干預(yù)，ZnPP組加入ZnPP 10 μmol/L; Hemin組加入Hemin 10 μmol/L;卡鉑組加入卡鉑10 μg/mL; Hemin聯(lián)合卡鉑組先加入Hemin 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL; ZnPP聯(lián)合卡鉑組先加入ZnPP 10 μmol/L，作用1 h后再加入卡鉑10 μg/mL。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加藥后均培養(yǎng)24 h。

1.3 Hep-2細(xì)胞存活率檢測(cè)采用MTT法。每孔加入5mg/mLmTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，徹底去上清后加DMSO 200 μL/孔，振蕩30min至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的光密度值(OD 值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。細(xì)胞存活率(%)=(OD試驗(yàn)孔/OD對(duì)照孔)×100%。

1.4 Hep-2細(xì)胞HO-1mRNA及HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法檢測(cè)各組Hep-2細(xì)胞HO-1mRNA表達(dá):各組加藥培養(yǎng)24 h后TRIzol法提取總RNA，取等量RNA(500 ng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。HO-1上游引物5'-CTTTGGTCAATGACACCGTG-3'，下游引物5'-TGTTTGTGGTAAGCCATCCA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度168 bp;β-actin上游引物5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下游引物5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度540 bp?；驍U(kuò)增反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5min; 95℃、30 s，57℃、30 s，72℃、30 s，β-actin 26個(gè)循環(huán)，HO-1 29個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃、2 h。產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用Lab Work5.0系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。采用Western blotting法檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá):各組加藥24 h后收集細(xì)胞，加入4℃預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液300

μL冰上裂解30min，期間細(xì)胞刮刀刮3次，4℃、12 000 r/min離心20min，取上清液5 μL，BCA法蛋白定量，取總蛋白量一致后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，然后置于5%脫脂奶粉TBST溶液封閉2 h，加入1∶2 000兔抗人HO-1一抗，同時(shí)用兔抗人β-actin(1∶500)作為內(nèi)參，4℃過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h后，TBST溶液洗滌15min/2次，ECL發(fā)光顯色，結(jié)果掃描，HO-1蛋白條帶灰度值測(cè)定。

1.5Hep-2細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測(cè)采用DCFH-DA探針檢測(cè)。加藥培養(yǎng)24 h后，胰酶消化、終止、收集細(xì)胞，收集細(xì)胞后裝載探針，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFHDA中，細(xì)胞密度為1×106/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，無血清培養(yǎng)基洗3次，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)，檢測(cè)各組熒光強(qiáng)度，結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度表示細(xì)胞內(nèi)ROS的相對(duì)活性。

1.6 Hep-2細(xì)胞凋亡率觀察加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化正常培養(yǎng)基終止消化后收集細(xì)胞，4℃預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心5min，重復(fù)2次，90%酒精固定－20℃保存12 h后，4℃預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心5min，重復(fù)2次，洗去酒精，制成單細(xì)胞懸液300 μL后加入PI使終濃度為10 μg/mL，室溫避光孵育20min，流式細(xì)胞儀計(jì)算細(xì)胞凋亡率。數(shù)據(jù)由ModFit2.0軟件系統(tǒng)分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率空白對(duì)照組為96.8%±1.09%，卡鉑組為75.3%±0.21%，ZnPP組為84.7%±0.04%，Hemin組為101.1%± 0.13%，ZnPP聯(lián)合卡鉑組為54.9%±0.31%，Hemin聯(lián)合卡鉑組為81.1%±0.19%; ZnPP組及卡鉑組明顯低于空白對(duì)照組; Hemin組明顯高于空白對(duì)照組; ZnPP聯(lián)合卡鉑組明顯低于卡鉑組，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯高于卡鉑組; P均＜0.05

2.2HO-1mRNA及HO-1mRNA蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組比較，卡鉑組和Hemin組HO-1mRNA和HO-1蛋白明顯升高，ZnPP組明顯下降(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯(lián)合卡鉑組HO-1mRNA和HO-1蛋白明顯降低，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯升高(P均＜0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1　各組HO-1mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)(相對(duì)表達(dá)量，)

表1　各組HO-1mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)(相對(duì)表達(dá)量，)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與卡鉑組比較，#P＜0.05。

組別　HO-1mRNA　HO-1蛋白空白對(duì)照組11 ZnPP組　0.25±0.03*　0.57±0.07*Hemin組　1.82±0.11*　1.47±0.01*卡鉑組　1.22±0.03*　1.23±0.10*ZnPP聯(lián)合卡鉑組　0.47±0.00#　0.94±0.02#Hemin聯(lián)合卡鉑組　1.86±0.03* #　2.35±0.12*#

圖1　各組HO-圖1mRNA表達(dá)

圖2　各組HO-圖1蛋白表達(dá)

2.3ROS相對(duì)活性空白對(duì)照組、ZnPP組、Hemin組、卡鉑組、ZnPP聯(lián)合卡鉑組、Hemin聯(lián)合卡鉑組平均熒光強(qiáng)度分別為1、1.79±0.12、0.59±0.09、2.30 ±0.11、3.91±0.04、1.21±0.02;與空白對(duì)照組比較，卡鉑組、ZnPP組ROS活性顯著增高(P均＜0.05);與卡鉑組比較，ZnPP聯(lián)合卡鉑組ROS活性明顯升高，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯降低(P均＜0.05)。

2.4細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組、ZnPP組、Hemin組、卡鉑組、ZnPP聯(lián)合卡鉑組、Hemin聯(lián)合卡鉑組細(xì)胞凋亡率分別為5.15%±1.27%、11.62%±1.02%、5.01%±0.94%、20.16%±1.02%、50.67%± 2.31%、13.62%±1.29%; Hemin組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);卡鉑組、ZnPP組明顯高于空白對(duì)照組(P均＜0.05); ZnPP聯(lián)合卡鉑組明顯高于卡鉑組，Hemin聯(lián)合卡鉑組明顯低于卡鉑組(P均＜0.05)。

3　討論

喉鱗癌早期癥狀隱匿、生長(zhǎng)速度快，且對(duì)放化療的敏感度低。HO-1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及化療抵抗之間的關(guān)系目前雖不甚清楚，但近年來正逐漸引起臨床重視［7，8］。研究表明，HO-1在一部分腫瘤組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，增加或降低HO-1的表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，目前在腫瘤治療過程中合理調(diào)控HO-1的表達(dá)正逐漸成為研究的一大熱點(diǎn)［9，10］。

Tan等［11］研究證實(shí)，在乳腺癌細(xì)胞中HO-1的高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其侵襲及轉(zhuǎn)

移，其潛在機(jī)制可能與HO-1促進(jìn)細(xì)胞核增殖抗原及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin B1等表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，Hemin作用于Hep-2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)HO-1mRNA和蛋白水平表達(dá)上調(diào)，而應(yīng)用ZnPP后細(xì)胞內(nèi)HO-1mRNA和蛋白水平表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活性降低。提示降低HO-1表達(dá)能夠抑制Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。單獨(dú)應(yīng)用化療藥物卡鉑后，細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)增高，這一結(jié)果與卡鉑可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS活性增強(qiáng)有關(guān)，ROS反應(yīng)水平的增高可激活下游氧化應(yīng)激反應(yīng)原件ARE，進(jìn)而激活Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，進(jìn)而減弱卡鉑對(duì)于Hep-2細(xì)胞的殺傷作用。而聯(lián)合應(yīng)用ZnPP抑制細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)后，細(xì)胞存活率下降、凋亡率顯著增加。由此提示Hemin可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，對(duì)人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷及化療藥物的殺傷存在部分保護(hù)作用，而聯(lián)合應(yīng)用ZnPP阻斷細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)后，能夠增強(qiáng)卡鉑對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷作用。該機(jī)制與HO-1在白血病、肺癌、胰腺癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞中的報(bào)道一致［12～17］。

目前研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞在放化療過程中產(chǎn)生的自我保護(hù)及抵抗可能與HO-1的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等均表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì);此時(shí)，HO-1及其代謝產(chǎn)物成為主要的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)體系［18～20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZnPP下調(diào)人喉鱗癌Hep-2細(xì)胞內(nèi)HO-1表達(dá)后，細(xì)胞存活率降低、凋亡率升高，細(xì)胞內(nèi)ROS活性增加;聯(lián)合應(yīng)用卡鉑化療后細(xì)胞凋亡率顯著升高，細(xì)胞內(nèi)ROS活性進(jìn)一步增加。而當(dāng)卡鉑聯(lián)合應(yīng)用Hemin后，細(xì)胞內(nèi)ROS活性及細(xì)胞凋亡率下降，由此表明HO-1可能通過調(diào)節(jié)ROS活性影響卡鉑對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)也有研究報(bào)道，HO-1還可通過調(diào)節(jié)Akt途徑和P21蛋白等方式影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，但具體機(jī)制不詳，還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，體外抑制HO-1表達(dá)能夠降低Hep-2細(xì)胞活性，增強(qiáng)卡鉑對(duì)Hep-2細(xì)胞的殺傷作用，其具體機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。HO-1可能在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展及治療過程中發(fā)揮重要作用，合理調(diào)控腫瘤細(xì)胞中HO-1表達(dá)有望成為喉鱗癌臨床治療的新突破。

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收稿日期:( 2015-06-30)

通信作者簡(jiǎn)介:王寶山(1963-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槎茄屎眍^頸外科學(xué)。E-mail: wbsent@126.com

作者簡(jiǎn)介:第一呂欣(1983-)，男，助理研究員，研究方向?yàn)槎茄屎眍^頸外科學(xué)。E-mail: lvxin1983doctor@163.com

基金項(xiàng)目:河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2013206264)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)36-0007-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R739.65

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.003