楊一晨 沈法榮 何浪

HCN4與心臟生物起搏研究進(jìn)展

楊一晨 沈法榮 何浪

HCN4作為超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道（HCN）基因家族在心臟中表達(dá)的主要亞型，負(fù)責(zé)編碼產(chǎn)生起搏電流，被稱為起搏基因。近年來，利用病毒載體轉(zhuǎn)染HCN4基因來構(gòu)建心臟生物起搏器取得了較大進(jìn)展，但目前尚局限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，其應(yīng)用于臨床實(shí)踐還有很多問題需要研究解決。現(xiàn)將HCN4與心臟生物起搏研究進(jìn)展作一綜述。

1 HCN4概述

正常心臟興奮起源于竇房結(jié)，并經(jīng)結(jié)間束傳導(dǎo)至房室結(jié)，通過房室結(jié)纖維，經(jīng)房室束、左右束支，最終傳導(dǎo)至心室浦肯野纖維。1976年，Noma等[1]首次在兔心臟竇房結(jié)組織記錄到一種特殊的電流，其在膜超極化時(shí)被激活，稱之為特種離子流（If）。1980年，Brown等[2]在竇房結(jié)起搏活動(dòng)研究中發(fā)現(xiàn)這一電流是超極化激活的內(nèi)向陽離子電流，且尚具有鈉鉀離子通透、細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸（cAMP）調(diào)節(jié)、微弱的單通道導(dǎo)電及被細(xì)胞外銫特異性阻斷等特性，稱之為超極化激活的陽離子電流（Ih），介導(dǎo)Ih的離子通道，即稱之為HCN，是Ih/If形成的分子基礎(chǔ)。HCN家族的基因產(chǎn)物包括HCN1～4四個(gè)成員。在哺乳動(dòng)物的心臟組織中4種基因亞型均被發(fā)現(xiàn)[3]，其中主要為HCN1、HCN2和HCN4，而竇房結(jié)中分布最為廣泛的是HCN4，HCN3則主要分布于神經(jīng)纖維上[4]。早在十余年前就有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)兔、鼠、狗竇房結(jié)上HCN4有顯著的表達(dá)[4-7]。其后，又有多個(gè)研究表明人竇房結(jié)組織中亦主要表達(dá)HCN4[8-9]。因此，目前認(rèn)為HCN通道屬于電壓門控陽離子通道家族成員，負(fù)責(zé)編碼產(chǎn)生If電流，而HCN4是其中在心臟竇房結(jié)細(xì)胞中表達(dá)最高的亞型。

2 HCN4與心臟起搏的關(guān)系

竇房結(jié)是心臟的起搏點(diǎn)，而竇房結(jié)中分布最多的是HCN4亞型，那么HCN4在心臟起搏活動(dòng)中究竟發(fā)揮了怎樣的作用呢？早在1999年就有Shi等[4]用RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的方法探測(cè)到HCN4基因?yàn)橥酶]房結(jié)中If離子流通道的主要編碼基因（占全部HCN亞型的80%以上），表明心臟起搏活動(dòng)主要由HCN4產(chǎn)生。2003年，Stieber等[10]進(jìn)行了一項(xiàng)基因剔除研究，結(jié)果表明，HCN4基因全部缺失的小鼠由于不能形成“成熟”的起搏動(dòng)作電位而不能存活，而部分缺失的小鼠心臟竇房結(jié)的自發(fā)搏動(dòng)頻率顯著下降超過50%。臨床方面，Schulze-Bahr等[11]研究了1例先天性竇房結(jié)功能紊亂的患者，發(fā)現(xiàn)該患者的HCN4基因中1個(gè)堿基缺失，將該突變的HCN4基因轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞（SV40病毒基因轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞）后發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的If樣離子電流對(duì)cAMP不敏感，提示突變的HCN4基因雖然可以表達(dá)，但其生物物理特性已經(jīng)改變，這可能是導(dǎo)致患者竇房結(jié)功能紊亂的原因。類似的臨床研究均表明HCN4突變的患者表現(xiàn)出了自發(fā)性竇房結(jié)功能失常[12-14]。這說明，HCN4基因在竇房結(jié)起搏細(xì)胞的自發(fā)電活動(dòng)中起著主要的作用。在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方面，國內(nèi)學(xué)者檢測(cè)到HCN4基因修飾的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞具有竇房結(jié)細(xì)胞類似的動(dòng)作電位，成功獲得了心臟起搏樣細(xì)胞[15]。上述研究均表明，HCN4是起搏基因，心臟起搏電流的產(chǎn)生和調(diào)控主要依賴于HCN4基因。

3 HCN4構(gòu)建生物起搏的相關(guān)研究

目前永久性人工心臟起搏器已廣泛應(yīng)用于臨床，但是起搏器植入仍存在一定比例的氣胸、導(dǎo)線脫位、心肌穿孔、囊袋感染等風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)面臨著起搏器壽命有限而需多次更換、原導(dǎo)線拔除、新導(dǎo)線植入等一系列問題。因此尋求更加符合人體需要的生物起搏器以修復(fù)竇房結(jié)或者重建心臟的起搏功能，從而替代電子起搏器，已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。生物起搏是指應(yīng)用細(xì)胞分子生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)對(duì)受損節(jié)律點(diǎn)或特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)或替代，使心臟起搏和傳導(dǎo)功能得以恢復(fù)。生物起搏主要包括細(xì)胞起搏和基因起搏。細(xì)胞起搏就是利用干細(xì)胞的高度自我更新和多向分化潛能這種生物特性，將其移植到受體心臟起搏點(diǎn)或傳導(dǎo)障礙的部位使之分化為起搏細(xì)胞，最終恢復(fù)心臟的起搏和傳導(dǎo)功能?；蚱鸩菓?yīng)用基因工程、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)及心肌生物電產(chǎn)生機(jī)制，對(duì)受損的自律性細(xì)胞或發(fā)生傳導(dǎo)障礙的特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行基因修復(fù)、替換和基因產(chǎn)物的補(bǔ)充或阻斷，以期通過導(dǎo)入基因的表達(dá)，補(bǔ)充缺乏的（或失去正常功能的）蛋白質(zhì)，使心臟的起搏和傳導(dǎo)功能得以恢復(fù)。本文著重談HCN4基因起搏。

HCN4基因被認(rèn)為是引起心臟電活動(dòng)的起搏基因，目前國內(nèi)外研究者已做過不少相關(guān)研究來探討HCN4基因構(gòu)建生物起搏器的可行性。2006年，李繼文等[16]成功構(gòu)建了HCN4重組腺病毒載體，感染COS-7細(xì)胞，并通過膜片鉗技術(shù)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中檢測(cè)到超極化激活的非選擇性內(nèi)向陽離子電流If，證實(shí)了HCN4基因的表達(dá)加強(qiáng)能增加起搏離子流If。Zhong等[17]通過注射HCN4腺病毒載體至大鼠左心室壁，通過刺激迷走神經(jīng)造成竇性停搏，產(chǎn)生的室性異位起搏心律其節(jié)律達(dá)到了生理需求。仝識(shí)非等[18]發(fā)現(xiàn)HCN4基因修飾的大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）有超極化激活的內(nèi)向電流，且該電流具有明顯的時(shí)間及電壓依賴特性，受cAMP調(diào)控，成功獲得起搏樣細(xì)胞。一項(xiàng)在體實(shí)驗(yàn)中，Cai等[19]在豬心室肌細(xì)胞注射轉(zhuǎn)染HCN4的腺病毒，房室結(jié)經(jīng)射頻導(dǎo)管消融形成完全性房室傳導(dǎo)阻滯，注射3～4d后發(fā)現(xiàn)豬心室率加快，且心率受異丙腎上腺素調(diào)控，經(jīng)轉(zhuǎn)染的心室肌細(xì)胞存在If電流，該研究表明：對(duì)于緩慢性心律失常的基因治療，應(yīng)用HCN4高表達(dá)的腺病毒載體是可行的。在此基礎(chǔ)上，Boink等[20]將HCN4基因通過慢病毒載體轉(zhuǎn)入幼鼠的心室肌細(xì)胞，通過膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HCN4心室肌細(xì)胞的If起搏電流較未轉(zhuǎn)染HCN4心室肌細(xì)胞高出10倍以上，并且出現(xiàn)竇房結(jié)細(xì)胞樣的舒張期緩慢去極化。類似還有研究發(fā)現(xiàn)陽性轉(zhuǎn)染HCN4的細(xì)胞中記錄到的If電流對(duì)低濃度銫敏感[21]。近年來一項(xiàng)將HCN4基因修飾的大鼠MSCs與乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳鼠心肌的自發(fā)搏動(dòng)頻率明顯增高，且兩者間建立了有效的電機(jī)械連接，為進(jìn)一步行生物起搏治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)[22]。以上所述的這些研究均表明：通過HCN4基因?qū)?，離體或在體局部高表達(dá)HCN4能形成自發(fā)的起搏，且該通道與生理性起搏離子流通道具有相同的動(dòng)力學(xué)特性，為建立新型有效的細(xì)胞生物起搏技術(shù)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 HCN4構(gòu)建生物起搏的局限性

以上所述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過起搏基因HCN4轉(zhuǎn)染種子細(xì)胞構(gòu)建心臟生物起搏器的可行性。然而，這類研究具有不可忽視的局限性。例如，通過這些方法構(gòu)建的生物起搏器，其形成的起搏心律的持續(xù)性沒有得到證實(shí)，在持久性、穩(wěn)定性方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上電子起搏器，因?yàn)榛虻谋磉_(dá)可能消失，并且相關(guān)的在體研究最長持續(xù)時(shí)間不到1個(gè)月[23]。使用病毒作為載體同樣也存在著問題。安全性好的腺病毒載體不能持久且表現(xiàn)出一定的過敏反應(yīng)，持久性好的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體則有生成贅生物的危險(xiǎn)。一種避免使用病毒媒介的方法是使用細(xì)胞移植的治療方法[24]，細(xì)胞被種植入心臟作為心臟起搏器的功能團(tuán)塊，然而，在細(xì)胞選擇、細(xì)胞分化、精確定位、轉(zhuǎn)移至宿主心肌的整合、免疫排斥等方面也存在著不少問題和挑戰(zhàn)。目前此類研究中應(yīng)用較多的慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在基因的持久表達(dá)上是不錯(cuò)的選擇，但它們?cè)隗w內(nèi)的安全性仍有待于進(jìn)一步證明。再者，目的基因隨機(jī)整合有可能導(dǎo)致正常細(xì)胞周期及抑癌基因的破壞，引起嚴(yán)重后果，因此基因轉(zhuǎn)染后還須評(píng)估插入位點(diǎn)，確保目的基因準(zhǔn)確克隆。并且由于竇房結(jié)細(xì)胞的起搏功能是多種機(jī)制共同參與完成的，因此進(jìn)一步闡明竇房結(jié)細(xì)胞的電生理特性有助于研發(fā)實(shí)用性更高、功能更加完善的生物起搏器。綜上所述，生物起搏目前仍局限于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，暫時(shí)不具有臨床上的可行性。

5 結(jié)語

HCN4作為超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因家族亞型，被認(rèn)為是心臟起搏細(xì)胞產(chǎn)生自動(dòng)節(jié)律的重要基礎(chǔ)，其中If是重要的起搏調(diào)控部分。HCN家族基因參與編碼If電流，由于HCN4與心臟起搏的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)關(guān)系密切，所以被稱為起搏基因，具有調(diào)控起搏的功能。近年來國內(nèi)外對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)功能以及與心臟生物起搏關(guān)系的研究不斷深入，以HCN4為目的基因，將慢病毒、腺病毒、質(zhì)粒、脂質(zhì)體等作為載體，重組后感染胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等多潛能干細(xì)胞，使之分化為具有起搏功能的細(xì)胞，或是在載體攜帶下直接注射入動(dòng)物體內(nèi)，用于構(gòu)建心臟生物起搏器。此類研究已取得較大進(jìn)展。但是目前生物起搏尚處于基礎(chǔ)研究階段，應(yīng)用于臨床前需要解決很多問題：例如病毒媒介存在的安全問題和遺傳突變的可能；生物起搏器的有效性、持續(xù)性和穩(wěn)定性，可能被心臟疾病進(jìn)程影響；基因?qū)氲臏?zhǔn)確性；宿主的免疫反應(yīng)等問題。因此要構(gòu)建真正類似正常起搏的生物起搏器需要更加深入的研究和探討。盡管生物起搏目前還存在諸多問題和挑戰(zhàn)，但是它向世人展示出了無窮的魅力和前景，可能成為臨床上繼電子起搏器之后治療緩慢性心律失常的新技術(shù)。目前學(xué)者們已將它作為心臟生物起搏領(lǐng)域的主要方向之一，相信不斷地深入研究，可使該領(lǐng)域的研究成果能早日應(yīng)用于臨床當(dāng)中。

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2014-07-18）

（本文編輯：楊麗）

310053浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江綠城心血管病醫(yī)院心臟中心（沈法榮、何浪）

沈法榮，E-mail：shenfarong2011@163.com