霍 倩，楊德林，楊定芳，顏汝平，王海峰，韋海榮，丁祥黎，唐釗然

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血管緊張素抑制劑纈沙坦對膀胱癌細(xì)胞表達(dá)的影響

霍 倩，楊德林，楊定芳，顏汝平，王海峰，韋海榮，丁祥黎，唐釗然

目的 探討纈沙坦對不同侵襲能力的膀胱癌細(xì)胞株血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ) 1型受體(AT1R)抗原、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)的影響。方法 對三株不同侵襲能力的細(xì)胞株EJ-M3、EJ、BIU-87進(jìn)行培養(yǎng)，使用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L纈沙坦的1640培養(yǎng)液作用于細(xì)胞株，采用細(xì)胞生長狀態(tài)測定法檢測細(xì)胞增殖狀況，確定最終藥物濃度。根據(jù)細(xì)胞株不同分為EJ-M3組、EJ組、BIU-87組，每組細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)亞組和對照亞組，實(shí)驗(yàn)亞組加入含有10-3mol/L纈沙坦的RPMI-1640培養(yǎng)液，對照亞組僅加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后抽提相應(yīng)蛋白和mRNA。采用Western blotting法測定AT1R、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平，采用RT-PCR法檢測AT1R、MMP-2和MMP-9基因的相對表達(dá)。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測3種膀胱癌細(xì)胞株的遷移能力和侵襲能力的改變。結(jié)果 依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)測定出的生長曲線選擇濃度為10-3mol/L的纈沙坦作為最終藥物濃度。Western blotting電泳結(jié)果顯示，AT1R、MMP-2、MMP-9在3個細(xì)胞株中均有表達(dá)，但均較對照亞組表達(dá)明顯降低。3組細(xì)胞株對照亞組AT1R、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)均高于實(shí)驗(yàn)亞組(P<0.05)。3組細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)亞組細(xì)胞遷移距離短于對照亞組(t=7.24、6.14、4.30，P<0.01)。3組細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)亞組侵入細(xì)胞數(shù)量較對照亞組少(t=6.24、4.33、2.81，P<0.01)。結(jié)論 纈沙坦可有效抑制膀胱癌細(xì)胞AT1R表達(dá)，進(jìn)而抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)。AT1R抑制劑有可能成為一種新的抑制膀胱癌轉(zhuǎn)移和延長膀胱癌患者生存期的藥物。

膀胱腫瘤；受體，血管緊張素，1型；纈沙坦；基質(zhì)金屬蛋白酶類

霍倩，楊德林，楊定芳，等.血管緊張素抑制劑纈沙坦對膀胱癌細(xì)胞表達(dá)的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(11)：1274-1279.[www.chinagp.net]

Huo Q，Yang DL，Yang DF，et al.Influence of angiotensin inhibiter valsartan on the expression of bladder cancer cells[J].Chinese General Practice，2015，18(11)：1274-1279.

血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)中一種主要的多功能活性肽，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ不僅調(diào)節(jié)血壓和體液平衡，而且可以作為一種多效應(yīng)生長因子影響細(xì)胞增殖和凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的基因表達(dá)和分泌、增加細(xì)胞對生長因子的敏感性，與血管再生關(guān)系密切。有研究顯示，Ang Ⅱ可以通過激活A(yù)ng Ⅱ 1型受體(AT1R)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤組織的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[1]。本研究使用AT1R抑制劑纈沙坦作用于3株膀胱癌細(xì)胞株，觀察其對細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響以及AT1R與MMP-2、MMP-9蛋白和基因表達(dá)的關(guān)系，探討Ang Ⅱ抑制劑對膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細(xì)胞株高侵襲力亞系EJ-M3(由前期實(shí)驗(yàn)篩選獲取)，膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞(由北京大學(xué)泌尿外科研究所余莉章教授惠贈)，膀胱癌細(xì)胞株BIU-87(購自中國科學(xué)院昆明動物所細(xì)胞室)，RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，胎牛血清(上海依科賽生物工程有限公司)，鼠抗人AT1R、MMP-2、MMP-9單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(美國Santa Cruz公司)，內(nèi)參抗體β-tubulin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，Trizol、M-MLV第一鏈合成試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(上海TOYOBO公司)，Western blotting配膠、電泳及轉(zhuǎn)膜液試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，Western blotting發(fā)光試劑(北京中杉中橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 3株膀胱癌細(xì)胞EJ-M3、EJ、BIU-87生長于含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 細(xì)胞生長狀態(tài)測定 取處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞，常規(guī)消化、分離、收集細(xì)胞及細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每種細(xì)胞株設(shè)5個復(fù)孔，貼壁后無血清培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使細(xì)胞同步化，棄去原培養(yǎng)液，每種細(xì)胞株分別加入含10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L纈沙坦的1640培養(yǎng)液200 μl(作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本)，RPMI-1640培養(yǎng)液200 μl(作為對照標(biāo)本)，設(shè)調(diào)零孔，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去含MTT的上清液，然后每孔加入DMSO 150 μl，震蕩5 min，充分溶解formazan結(jié)晶。把96孔板放在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，比色測定波長為490 nm吸光值(OD值)，然后計(jì)算3株細(xì)胞的生長抑制率，抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)標(biāo)本平均OD值/對照標(biāo)本平均OD值)×100%。

1.2.3 分組根據(jù) 根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)測定出的生長曲線選擇濃度為10-3mol/L的纈沙坦作為最終藥物濃度。根據(jù)細(xì)胞株不同分為EJ-M3組，EJ組，BIU-87組，每組細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)亞組和對照亞組，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在6孔板無血清培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)亞組加入含有10-3mol/L纈沙坦的RPMI-1640培養(yǎng)液，對照亞組只加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，抽提相應(yīng)蛋白和mRNA。

1.2.4 Western blotting法 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并檢測蛋白濃度。配置10%聚丙烯酰胺分離膠及5%積成膠。取總蛋白100 μg變性后加樣，90 V條件下電泳，電泳緩沖液為Tris-甘氨酸；然后在100 V、4 ℃條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜2 h，分別加入鼠抗人AT1R、MMP-2、MMP-9單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜；在分別加入羊抗鼠IgG(1∶2 000)，特異性蛋白信號條帶的觀察使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑，膠片成像。

1.2.5 RT-PCR法 應(yīng)用Primer Express軟件設(shè)計(jì)基因特異性PCR引物序列(見表1)，采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。然后嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。每一個樣品均進(jìn)行3個重復(fù)反應(yīng)。同時設(shè)無模板對照。在熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。分析3株膀胱癌細(xì)胞株AT1R、MMP-2和MMP-9 mRNA的相對表達(dá)情況。采用ΔΔCT法進(jìn)行相對定量分析，ΔCT值為目的基因CT值(循環(huán)數(shù))與管家基因GAPDH CT值(循環(huán)數(shù))的差值，ΔΔCT為各實(shí)驗(yàn)亞組ΔCT與選擇的對照亞組ΔCT的差值。平均相對含量=2-ΔΔCT，為相對于對照亞組的mRNA水平。

表1 RT-PCR引物序列

注：AT1R=血管緊張素Ⅱ 1型受體，MMP-2=基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 采用記號筆在6孔板背后利用直尺均勻劃5條橫線，每個實(shí)驗(yàn)亞組均設(shè)3個平行樣本。3株膀胱癌細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁率為100%時，用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)亞組加入含有10-3mol/L纈沙坦的RPMI-1640培養(yǎng)液，對照亞組加入無血清培養(yǎng)基放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)過程，取24 h為時間點(diǎn)拍照記錄。

1.2.7 Transwell細(xì)胞小室檢測細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，將液化的Matrigel與預(yù)冷無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液按1∶8稀釋，配足量(冰浴上操作)，然后加入上室各100 μl，放入37 ℃培養(yǎng)箱中2～4 h使其成膠；在實(shí)驗(yàn)亞組下室中預(yù)先加入600 μl含10-3mol/L纈沙坦的RPMI-1640培養(yǎng)液，對照亞組加600 μl RPMI-1640培養(yǎng)液；將細(xì)胞懸浮計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/ml，用無血清培養(yǎng)基洗Matrigel膠1次，取細(xì)胞懸液100 μl/孔加入上室，設(shè)3個重復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，用PBS洗2次并用棉簽小心刮除上室細(xì)胞，用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min；蘇木精-伊紅染色5 min，PBS洗2次；染色后光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)膜背面侵襲的細(xì)胞數(shù)量，隨機(jī)計(jì)數(shù)中間和四周共5個視野，每組細(xì)胞計(jì)數(shù)3份，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長狀態(tài) 使用10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L纈沙坦處理過的細(xì)胞，EJ-M3的抑制率分別是97.42%、68.21%、65.84%、58.25%、56.83%、36.81%、24.30%、13.39%；EJ的抑制率分別是89.54%、41.67%、38.69%、34.06%、22.58%、19.70%、16.57%、8.25%；BIU-87的抑制率分別是85.74%、46.09%、44.75%、30.15%、28.43%、20.16%、17.29%、6.15%。

2.2 AT1R、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) Western blotting電泳結(jié)果顯示，AT1R、MMP-2、MMP-9在3個細(xì)胞株中均有表達(dá)，但均較對照亞組表達(dá)明顯降低(見圖1)。

注：1= EJ-M3對照亞組，2= EJ-M3實(shí)驗(yàn)亞組，3= EJ對照亞組，4= EJ實(shí)驗(yàn)亞組，5= BIU-87對照亞組，6= BIU-87實(shí)驗(yàn)亞組；AT1R=血管緊張素Ⅱ 1型受體，MMP-2=基質(zhì)金屬蛋白酶2，MMP-9=基質(zhì)金屬蛋白酶9

圖1 3組細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)亞組和對照亞組AT1R、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

Figure 1 The protein expression of AT1R、MMP-2 and MMP-9 in three cells between experiment subgroup and control subgroup

2.3 AT1R、MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá) 3組細(xì)胞株對照亞組AT1R、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)均高于實(shí)驗(yàn)亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2～4)。

Table 2 Comparison of expression of AT1R mRNA in three cells between experiment subgroup and control subgroup

組別EJ-M3EJBIU-87對照亞組8.32±0.316.28±0.615.52±0.22實(shí)驗(yàn)亞組3.39±0.143.31±0.192.59±0.24t值21.436.5712.73P值<0.001<0.010<0.001

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：劃痕處理24 h后，EJ-M3對照亞組和實(shí)驗(yàn)亞組細(xì)胞的遷移距離分別為(2.28±0.07)、(1.57±0.12)μm。EJ對照亞組和實(shí)驗(yàn)亞組細(xì)胞的遷移距離分別為(1.66±0.13)、(1.07±0.04)μm。BIU-87對照亞組和實(shí)驗(yàn)亞組細(xì)胞的遷移距離分別為(1.24±0.09)、(0.81±0.11)μm。與對照亞組相比，實(shí)驗(yàn)亞組細(xì)胞遷移距離降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.24、6.14、4.30，P<0.01，見圖2)。

Table 3 Comparison of expression of MMP-2 mRNA in three cells between experiment subgroup and control subgroup

組別EJ-M3EJBIU-87對照亞組8.77±0.586.31±0.412.37±0.02實(shí)驗(yàn)亞組4.91±0.233.86±0.430.85±0.05t值8.7713.888.94P值<0.01<0.01<0.01

Table 4 Comparison of expression of MMP-9 mRNA in three cells between experiment subgroup and control subgroup

組別EJ-M3EJBIU-87對照亞組3.61±0.032.98±0.172.59±0.24實(shí)驗(yàn)亞組1.18±0.110.94±0.120.85±0.02t值30.3713.8710.23P值<0.001<0.010<0.010

2.5 細(xì)胞株細(xì)胞基質(zhì)侵襲能力 Transwell細(xì)胞小室檢測細(xì)胞侵襲能力結(jié)果顯示：EJ-M3實(shí)驗(yàn)亞組侵入細(xì)胞數(shù)量為(154.28±6.24)個，對照亞組為(233.39±8.18)個；EJ實(shí)驗(yàn)亞組為(107.88±6.38)個，對照亞組為(150.05±4.73)個；BIU-87實(shí)驗(yàn)亞組為(50.81±3.41)個，對照亞組為(87.19±5.56)個。3組細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)亞組侵入細(xì)胞數(shù)量較對照亞組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.24、4.33、2.81，P<0.01，見圖3)。

3 討論

膀胱癌是我國最常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均占泌尿系腫瘤的首位，且有逐年增加的趨勢。膀胱癌的主要生物學(xué)特性是易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高[2]。惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的復(fù)雜過程。在這個過程中，腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的過程可描述為三個步驟：依附、基質(zhì)降解和遷移。首先腫瘤細(xì)胞附著到基質(zhì)，然后腫瘤細(xì)胞直接分泌某種蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)。這種蛋白酶可以降解基質(zhì)結(jié)構(gòu)的膠原蛋白和附著蛋白。最后腫瘤細(xì)胞橫跨基底膜和基質(zhì)通過該區(qū)域。浸潤細(xì)胞外基質(zhì)是通過這三個步驟的循環(huán)完成的[3]。在腫瘤細(xì)胞分泌的蛋白水解酶中，MMP-2和MMP-9占有重要地位。MMPs能夠降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分和腫瘤細(xì)胞周圍的結(jié)締組織與基底膜，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。

注：A=EJ-M3對照亞組，B=EJ-M3實(shí)驗(yàn)亞組，C=EJ對照亞組，D=EJ實(shí)驗(yàn)亞組，E=BIU-87對照亞組，F(xiàn)=BIU-87實(shí)驗(yàn)亞組

圖2 3組細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)亞組和對照亞組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

Figure 2 The result of cell wound scratch test of three cell lines of experiment subgroup and control subgroup

MMPs可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，大量研究證實(shí)，實(shí)體腫瘤的進(jìn)一步生長、浸潤及血行轉(zhuǎn)移有賴于腫瘤新生血管的形成。腫瘤血管生成是一個非常復(fù)雜的過程，大致分為三個步驟：(1)血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)的降解；(2)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖；(3)毛細(xì)血管的分化吻合。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)對血管生成的多個環(huán)節(jié)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移和管腔狀結(jié)構(gòu)的形成，血管內(nèi)皮基底膜的降解等均有明顯的促進(jìn)作用。眾多研究表明，MMP-9能夠促進(jìn)VEGF合成，MMP-2和MMP-9的表達(dá)與結(jié)直腸癌新生血管形成有密切關(guān)系，能夠分泌產(chǎn)生MMP-2和MMP-9的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力[4-6]。Qiao等[7]研究結(jié)果表明，在腎細(xì)胞癌組織中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常腎組織。隋銳等[8]通過免疫組織化學(xué)方法分別檢測腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和正常腦組織MMP-2和MMP-9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本的表達(dá)比正常腦組織的表達(dá)高，并隨病理分期的增高而增高。

注：G=EJ-M3對照亞組，H=EJ-M3實(shí)驗(yàn)亞組，I=EJ對照亞組，J=EJ實(shí)驗(yàn)亞組，K=BIU-87對照亞組，L=BIU-87實(shí)驗(yàn)亞組

圖3 3組細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)亞組和對照亞組細(xì)胞株侵襲能力(蘇木精-伊紅染色，×200)

Figure 3 The invasion ability of in three cells between experiment subgroup and control subgroup

腎素-血管緊張素-醛固酮(RAS)系統(tǒng)中，通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的作用使血管緊張素Ⅰ(AngⅠ)水解產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，AngⅡ通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。AngⅡ受體包括AT1R和AT2R。AT1R大多分布于血管、心、腦、腎及肝臟中，而AT2R主要分布于胚胎組織、腎上腺髓質(zhì)、子宮、卵泡中[9]。Ang Ⅱ可通過激活A(yù)T1R發(fā)揮促腫瘤生長轉(zhuǎn)移作用[10]，最近發(fā)現(xiàn)AT1R在多種腫瘤組織中表達(dá)，AT1R在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞和組織中有高水平表達(dá)[11-13]。Akhavan等[14]采用免疫印跡方法分析在黑色素瘤中通過AngⅡ表達(dá)的不同的影響因子，發(fā)現(xiàn)在B16F10黑色素瘤細(xì)胞中AngⅡ通過激活A(yù)T1R可以促進(jìn)MMP-2，MMP-3和VEGF的表達(dá)，而不能促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，從而使得血管緊張素受體拮抗劑在腫瘤的藥物治療中扮演重要的角色。

為了解AT1R拮抗劑纈沙坦在膀胱癌中的作用，探討以AT1R為靶點(diǎn)治療膀胱癌的可能性，本研究采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度纈沙坦對細(xì)胞株的影響，選出最佳濃度為10-3mol/L纈沙坦作用于細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分別采用Western blotting和RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測3種細(xì)胞株用藥前后AT1R、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)和基因表達(dá)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過10-3mol/L纈沙坦處理過的細(xì)胞其蛋白表達(dá)均下降，3種細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)亞組較對照亞組表達(dá)明顯降低。RT-PCR檢查顯示，經(jīng)過10-3mol/L纈沙坦處理過的細(xì)胞與對照亞組比較mRNA表達(dá)下降，本研究分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平進(jìn)一步證實(shí)了不同侵襲能力的膀胱癌細(xì)胞株中AT1R、MMP-2和MMP-9的表達(dá)，而且這種表達(dá)可被AT1R拮抗劑所阻斷。

腫瘤細(xì)胞侵襲力是影響患者預(yù)后及生存率的關(guān)鍵因素。本研究通過Transwell細(xì)胞小室檢測經(jīng)過10-3mol/L纈沙坦處理過的細(xì)胞與對照亞組侵襲能力的改變。光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)膜背面細(xì)胞侵入3種細(xì)胞株細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)亞組較對照亞組侵入細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示纈沙坦可以降低膀胱腫瘤的侵襲能力。

遷移在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中也必不可少。腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離，穿過血管壁、侵襲正常組織，需要一定的運(yùn)動能力。研究已表明纈沙坦與膀胱癌細(xì)胞的遷移有密切的關(guān)系。本研究方法借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏y定腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上的運(yùn)動特性，結(jié)果顯示，劃痕處理24 h后，3種細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)亞組與對照亞組比較遷移距離縮短，提示纈沙坦作用于細(xì)胞后可以抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，AT1R與膀胱癌細(xì)胞的活性密切相關(guān)，通過抑制膀胱癌細(xì)胞內(nèi)AT1R表達(dá)從而抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而影響膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究提示血管緊張素抑制劑纈沙坦可為預(yù)防和治療膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移提供新思路，通過阻斷AT1R而抑制腫瘤生長和血管生成將可能會成為一種對抗癌癥的行之有效的策略。

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本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)將膀胱癌細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)觀察裸鼠致瘤率情況，并且使用不同劑量纈沙坦飼養(yǎng)裸鼠，從而進(jìn)一步證實(shí)血管緊張素抑制劑對腫瘤血管形成的影響。

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(本文編輯：賈萌萌)

Influence of Angiotensin Inhibiter Valsartan on the Expression of Bladder Cancer Cells

HUOQian，YANGDe-lin，YANGDing-fang，etal.

DepartmentofUrinarySurgery，theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650101，China

Objective To study the effect of Valsartan on angiotensin Ⅱ inhibitors(AngⅡ)type 1 receptor (AT1R)antigen，matrix metalloproteinase-2(MMP-2)，matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in bladder cancer(BC)cell lines of different invasive abilities.Methods Three cell strains(EJ-M3，EJ，BIU-87)of different invasive abilities were cultured.This study used Valsartan (10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9mol/L)to effect on cell lines in 1640 culture solutions，used cell growth status assay to detect cell proliferation to determine the final drug concentration.The cell strains were divided into groups EJ-M3，EJ，BIU-87，and each group subdivided into subgroups study，control.Valsartan RPMI-1640 culture solution containing 10-3mol/L was added into study subgroup，serum-free RPMI-1640 culture into control subgroup and corresponding protein and mRNA were extracted after 48 h of culture.The expressions of AT1R，MMP-2，MMP-9 proteins were determined by Western blotting，the relative expressions of AT1R，MMP-2，MMP-9 genes by RT-PCR method.The changes of the abilities of transfer，invasion of 3 BC cell lines were detected by cell wound scratch test，Transwell in vivo cell invasion assay.Results The growth curve measured by MTT assay chose the valsartan of 10-3mol/L as final drug concentration.By Western blotting electrophoresis AT1R,MMP-2，MMP-9 were expressed in 3 cell lines，but lower than in control subgroups.The relative expressions of MMP-2，MMP-9 mRNA were higher in control subgroups than in study subgroups(P<0.05).The transfer distances were shorter in study subgroups than in control subgroups(t=7.24，6.14，4.30，P<0.01).The invasive cell number was fewer in study subgroups than in control subgroups(t=6.24，4.33，2.81，P<0.01).Conclusion Valsartan can inhibit the expression of AT1R effectively，thus to inhibit the expressions of MMP-2，MMP-9.AT1R inhibitor may become a new drug inhibiting BC metastasis and prolonging patients′ life span.

Bladder cancer；Receptor，angiotensin，type 1；Valsartan；Matrix metalloproteinases

云南省科技廳資助項(xiàng)目(2011FB197)——昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)

650101云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 云南省泌尿外科研究所(霍倩，楊德林，顏汝平，王海峰，韋海榮，丁祥黎，唐釗然)；保山中醫(yī)藥高等專科學(xué)校(楊定芳)

楊德林，650101云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科 云南省泌尿外科研究所；E-mail：ydelin@163.com

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.11.011

2014-11-08；

2015-01-20)