崔喜艷，趙吉元，胡廣宇，竇 瑤，劉相國(guó)，韓四平

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130124; 3 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

玉米AGPase-bt2與GPN1蛋白互作的雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究

崔喜艷1,2，趙吉元1，胡廣宇1，竇 瑤3，劉相國(guó)2，韓四平2

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130124; 3 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

【目的】 解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)與糖酵解關(guān)鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPN1)在植物體內(nèi)是否存在相互作用?！痉椒ā?首先克隆獲得AGPase-bt2和GPN1基因，然后采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BiFC)，構(gòu)建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1雙分子熒光表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并用2種載體共同瞬時(shí)侵染煙草葉肉細(xì)胞，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察AGPase-bt2與GPN1的相互作用?！窘Y(jié)果】AGPase-bt2基因長(zhǎng)1 428 bp，GPN1基因長(zhǎng)1 497 bp。雙酶切鑒定結(jié)果表明，326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-GPN1載體構(gòu)建正確；PCR結(jié)果證實(shí)，植物表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中；攜帶有共轉(zhuǎn)化基因的煙草葉肉細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察到明顯的黃色熒光現(xiàn)象，且黃色熒光與葉綠體自發(fā)的紅色熒光位置重合?！窘Y(jié)論】 AGPase-bt2與GPN1在植物細(xì)胞中真實(shí)地存在蛋白互作。

AGPase-bt2；GPN1；雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)；蛋白質(zhì)互作

玉米(Zeamays)是重要的糧食作物和工業(yè)生產(chǎn)原料，淀粉是玉米籽粒中的主要貯藏物質(zhì)[1]。大量研究結(jié)果表明，在玉米淀粉代謝過程中，多種淀粉代謝相關(guān)的酶形成多酶復(fù)合物，通過相互作用的形式參與調(diào)節(jié)淀粉的代謝過程，這種復(fù)合物的形成及蛋白的相互作用涉及到與糖代謝相關(guān)的所有代謝途徑，同時(shí)促進(jìn)了糖異生、糖酵解和淀粉合成等多種不同代謝途徑在空間位置關(guān)系上的拉近，預(yù)示著幾種代謝途徑存在著共同的代謝底物[2-3]。淀粉的代謝是一個(gè)復(fù)雜的生物過程，在玉米胚乳中，蔗糖在蔗糖合成酶作用下先被分解為果糖和UDP-葡萄糖，進(jìn)而在磷酸變位酶和UDPG焦磷酸化酶作用下形成1-磷酸葡萄糖(G-1-P)[4]；G-1-P在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的作用下形成淀粉合成所需的重要前體物質(zhì)ADP-葡萄糖，然后再轉(zhuǎn)移到造粉體中進(jìn)一步生成淀粉[5]。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶((ADP-Glucose pyrophosphorylase，AGPase)分為胞質(zhì)型和質(zhì)體型2種，每種AGPase均由2個(gè)大亞基(AGPase-bt1)和2個(gè)小亞基(AGPase-bt2)組成，是淀粉生物合成的限速酶之一，在為淀粉合成提供前體物質(zhì)ADP-葡萄糖的反應(yīng)中，AGPase-bt2主要起催化作用[6]。

直鏈和支鏈淀粉在合成的同時(shí)也不斷地降解，糖酵解就是其中一個(gè)重要的降解途徑[7-8]。J?rg等[9]、Kirby等[10]研究表明，糖酵解途徑過程不僅存在于細(xì)胞溶質(zhì)中，其關(guān)鍵中間代謝物在質(zhì)體中也存在，并且中間代謝物在細(xì)胞溶質(zhì)和質(zhì)體之間存在一定的物質(zhì)交流。糖酵解途徑中通過一系列特異性酶的催化將葡萄糖分解成丙酮酸，同時(shí)伴有少量ATP生成[11]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPN1)是糖酵解過程的關(guān)鍵酶，其主要生物學(xué)功能是催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化，生成1,3-二磷酸甘油酸[12]。GPN1酶活性大小直接影響葡萄糖分解為丙酮酸的程度，以及生成ATP的速度。從物質(zhì)代謝和能量代謝的角度來說，淀粉的合成和糖酵解是相反卻又密不可分的兩種代謝。因此，研究糖酵解途徑和淀粉代謝中各自關(guān)鍵酶是否也參與形成多酶復(fù)合物，以及是否互作具有重要意義。

雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)分析技術(shù)是Hu等[13]最先報(bào)道的一種在活細(xì)胞中判斷目標(biāo)蛋白相互作用和定位的直觀、快速的新技術(shù)。該技術(shù)將熒光蛋白分割成兩個(gè)沒有熒光活性的分子片段，并將待檢測(cè)的兩個(gè)目標(biāo)蛋白分別與它們連接。若這兩個(gè)目標(biāo)蛋白之間存在相互作用，則無熒光活性的這兩個(gè)熒光分子片段就會(huì)因相互靠近而形成有活性的熒光基團(tuán)，因此在熒光顯微鏡下會(huì)檢測(cè)到熒光，反之則檢測(cè)不到熒光。前期，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所實(shí)驗(yàn)室已利用酵母雙雜交技術(shù)，對(duì)AGPase-bt2與GPN1的互作關(guān)系在酵母體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證(結(jié)果未發(fā)表)，但酵母雙雜交的假陽性幾率較高[13]，且不能說明在植物體內(nèi)兩種蛋白同樣會(huì)存在相互作用。而BiFC技術(shù)可以高度模擬植物自然形態(tài)下細(xì)胞的生理形態(tài)[14-15]，利用這種技術(shù)已成功驗(yàn)證玉米SSI與PPDK1[16]之間的蛋白互作，在此研究基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)以質(zhì)體型AGPase-bt2和糖酵解關(guān)鍵酶GPN1為材料，在煙草活細(xì)胞中力求真實(shí)還原AGPase-bt2和GPN1在植物體內(nèi)的蛋白互作關(guān)系，以期為進(jìn)一步解析玉米淀粉生物合成和糖酵解途徑的關(guān)系提供研究方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料：大葉煙草種子由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室保存提供。

質(zhì)粒及菌種：pGBKT7-AGPase-bt2質(zhì)粒、pGADT7-GPN1質(zhì)粒(分別含有從玉米中克隆的AGPase-bt2和GPN1編碼框的目的基因)，均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所保存提供；熒光互補(bǔ)表達(dá)載體，陰性質(zhì)粒326-CYNEE、326-CYCHA，陽性質(zhì)粒326-CYNEE-CYCH、326-CYCHA-CDKD(CYCH為細(xì)胞周期素 H(cyclin H)，CDKD為細(xì)胞周期依賴激酶D型(cyclin-dependent kinases D)，二者存在蛋白互作關(guān)系[17])均由中國(guó)科學(xué)院植保所饋贈(zèng)；大腸桿菌菌株E.coliDH5α、農(nóng)桿菌菌株EHA105由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所保存提供。

酶及生物試劑：PCR所用擴(kuò)增酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒均購(gòu)于TAKARA公司；氯化鎂、乙酰丁香、2-嗎啉乙磺酸、水飽和酚、氯仿和異戊醇等均購(gòu)自沈陽聯(lián)星公司；酵母提取物、蛋白胨購(gòu)自O(shè)XIXD公司，瓊脂粉購(gòu)自BD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米AGPase-bt2和GPN1基因的PCR擴(kuò)增 分別以pGBKT7-AGPase-bt2和pGADT7-GPN1質(zhì)粒為模板，采用帶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物5′端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)CTCGAG，下游引物5′端添加BamHⅠ酶切位點(diǎn)GGATCC。引物由北京生工有限公司合成。

AGPase-bt2基因PCR上游引物F1：5′-CCGCTCGAGATGGCGGCATCGGTTTCC-3′，下游引物R1：5′-CGGGATCCTGACAAGCACCTGAGCTGCAGCTA-3′；

GPN1基因PCR上游引物F2：5′-CCGCTCGAGATGGCGCTGGCGGGGAC-3′，下游引物R2：5′-CGGGATCCTGCCCATGGTGTAGGATGGTGACG-3′。

PCR擴(kuò)增條件為： 98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 160 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察記錄結(jié)果。

1.2.2 雙分子熒光互補(bǔ)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定AGPase-bt2基因和GPN1 基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行(XhoⅠ/BamHⅠ)雙酶切，分別與同樣用XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切的326-CYCHA載體、326-CYNEE載體16 ℃過夜連接，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，鑒定成功的陽性克隆送北京生工有限公司測(cè)序。

1.2.3 AGPase-bt2和GPN1分子相互結(jié)合的BiFC分析 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105， 28 ℃過夜搖菌，提質(zhì)粒后PCR驗(yàn)證陽性克隆，同時(shí)以轉(zhuǎn)化陽性和陰性質(zhì)粒為對(duì)照。將2種陽性克隆及2種對(duì)照分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，YEP液體培養(yǎng)基28 ℃搖菌過夜培養(yǎng)，3 000g離心5 min，棄上清，將收集的菌體分別用稀釋液(pH 5.6，10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，150 μmol/L AS)溶解后稀釋至OD600為1.0左右，使含有待測(cè)重組質(zhì)粒的菌液濃度達(dá)到一致后等體積混合，同時(shí)稀釋陽性和陰性質(zhì)粒菌液至OD600為1.0作為對(duì)照。用滅菌針頭在煙草葉片下表面扎2～4個(gè)小孔；用1 mL的無針頭注射器將2種重組質(zhì)粒、2種陽性質(zhì)粒和2種陰性質(zhì)粒的混合溶液分別平穩(wěn)注入煙草下表皮扎孔處；將煙草葉片用保鮮膜包住。在28 ℃溫室中培養(yǎng)48 h后，取出煙草葉片，用刀片和鑷子撕取葉片下表皮注射農(nóng)桿菌的部分；將標(biāo)本置于載玻片上，表面滴1滴體積分?jǐn)?shù)15%的甘油，覆上蓋玻片，使用激光共聚焦顯微鏡(515 nm黃光激發(fā)光、100×物鏡)觀察煙草表皮細(xì)胞熒光的蛋白表達(dá)情況，并拍照保存試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 AGPase-bt2和GPN1基因的PCR擴(kuò)增

分別以含有目的基因的質(zhì)粒pGBKT7-AGPase-bt2、pGADT7-GPN1為模板，以F1/R1、F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖1)與預(yù)期大小一致。

由圖1可見，AGPase-bt2基因大小為1 428 bp，GPN1基因大小為1 497 bp。用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。分別獲得上游帶XhoⅠ酶切位點(diǎn)、下游帶BamHⅠ酶切位點(diǎn)的AGPase-bt2基因PCR產(chǎn)物和GPN1基因PCR產(chǎn)物。

2.2 雙分子熒光互補(bǔ)表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

AGPase-bt2基因和GPN1基因的PCR擴(kuò)增片段分別經(jīng)XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切后，分別與同樣經(jīng)XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切的熒光載體326-CYCHA和326-CYNEE進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，AGPase-bt2基因條帶大小為1 400 bp左右，GPN1基因條帶大小為1 500 bp左右，與PCR產(chǎn)物大小相符(圖2)。將鑒定的陽性克隆菌株送至北京生工有限公司測(cè)序,發(fā)現(xiàn)所得序列與GenBank報(bào)道的玉米AGPase-bt2基因和GPN1基因序列一致，相似度為100%，證明成功構(gòu)建了玉米326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-GPN1重組質(zhì)粒。

2.3 AGPase-bt2與GPN1互作的BiFC分析

將構(gòu)建好的重組載體326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1共同瞬時(shí)侵染煙草葉肉細(xì)胞48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)，同時(shí)設(shè)置326-CYCHA-CDKD、326-CYNEE-CYCH為陽性對(duì)照，空載體326-CYNEE、326-CYCHA作為陰性對(duì)照，結(jié)果見圖3。圖3中，(1)是在自然光下觀察到的細(xì)胞；(2)是細(xì)胞葉綠體在激發(fā)后產(chǎn)生的紅色熒光；(3)為在激發(fā)光下觀察到的黃色熒光蛋白發(fā)光；(4)為葉綠體在激發(fā)后產(chǎn)生的自發(fā)紅色熒光和激發(fā)光下蛋白互作產(chǎn)生的黃色熒光的疊加結(jié)果；(5)為在完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)中觀察到的YFP激發(fā)光下的蛋白互作位點(diǎn)。由圖3可見，陽性對(duì)照組(326-CYCHA-CDKD和326-CYNEE-CYCH)可檢測(cè)到明顯的黃色熒光信號(hào)；陰性對(duì)照組(326-CYCHA 和326-CYNEE)檢測(cè)不到黃色熒光；試驗(yàn)組(326-CYCHA-AGPase-bt2 和326-CYNEE-GPN1)在YFP激發(fā)光下可以檢測(cè)到較為明顯的黃色熒光信號(hào)，與陽性對(duì)照組結(jié)果一致，表明AGPase-bt2和GPN1蛋白能夠在植物細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合。

3 討 論

禾本科植物種子中貯存的主要物質(zhì)是淀粉和蛋白質(zhì)，二者的含量直接影響籽粒的品質(zhì)和產(chǎn)量[18]。AGPase-bt2是玉米胚乳淀粉代謝關(guān)鍵酶AGPase基因的一個(gè)突變體小亞基，它的主要生物學(xué)作用是以1-磷酸葡萄糖為原料，在ATP的供能下生成焦磷酸以及ADPG。AGPase-bt2主要存在于玉米胚乳的造粉質(zhì)體內(nèi)[19]。研究人員在1995年發(fā)現(xiàn)，AGPase對(duì)玉米生長(zhǎng)進(jìn)程中的某些生理活性起著關(guān)鍵性作用[20]。AGPase-bt2主要催化G-1-P在ATP的參與下合成腺苷二磷酸葡萄糖ADPG[21]。AGP酶催化淀粉合成的限速步驟，在玉米胚乳的淀粉合成過程中起著至關(guān)重要的作用[22]。GPN1是一個(gè)管家基因，可催化甘油醛-3-磷酸氧化磷酸化生成1,3-二磷酸甘油酸[23]。甘油醛3-磷酸脫氫酶在糖酵解過程中起到關(guān)鍵作用，參與葉片的光合作用，同時(shí)種子中的甘油醛3-磷酸脫氫酶參與淀粉的合成。AGPase-bt2 和GPN1蛋白的互作，使得淀粉合成與糖酵解途徑之間建立了某種聯(lián)系，在玉米淀粉積累的過程中，糖酵解為淀粉積累提供了直接能量ATP，同時(shí)可以有效地加速碳代謝流。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了熒光表達(dá)載體，并通過激光共聚焦顯微鏡觀察到326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1的共轉(zhuǎn)染組和陽性對(duì)照組均有明顯的黃色熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照組沒有黃色熒光信號(hào)，表明AGPase-bt2 和GPN1蛋白在植物體內(nèi)存在相互作用，且黃色熒光信號(hào)與葉綠體自發(fā)的紅色熒光信號(hào)位置重合，推測(cè)發(fā)生互作的亞細(xì)胞可能位于葉綠體內(nèi)。AGPase-bt2 和GPN1蛋白互作的亞細(xì)胞定位有待于進(jìn)一步研究。

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Interaction between AGPase-bt2 and GPN1 in maize using bimolecular fluorescence complementation

CUI Xi-yan1,2,ZHAO Ji-yuan1,HU Guang-yu1,DOU Yao3,LIU Xiang-guo2,HAN Si-ping2

(1SchoolofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China; 2InstituteofAgriculturalBiotechnology,JilinAcademyofAgriculturalSciences,Changchun,Jilin130124,China;3SchoolofLifeSciences,JilinUniversity,Changchun,Jilin130012,China)

【Objective】 This study aimed to clarify the interaction between starch synthesis rate-limiting enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase-bt2) and glycolytic key enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPN1) in maize.【Method】AGPase-bt2 andGPN1 gene was cloned first.Bimolecular fluorescence complementation(BiFC) was used to construct the bimolecular fluorescence expression vectors 326-CYCHA-AGPase-bt2 and 326-CYNEE-GPN1 and they were transformed intoAgrobacteriumtumefaciensEHA105.Then two vectors were used to dip tobacco mesophyll cells momentarily and the interaction between AGPase-bt2 and GPN1 was observed by using confocal laser scanning microscope after 48 hours.【Result】AGPase-bt2 gene length is 1 428 bp,andGPN1 gene length is 1 497 bp.The 326-CYCHA-AGPase-bt2 and 326-CYNEE-GPN1 vectors were constructed correctly by double enzyme digestion and expressed successfully by PCR.The tobacco mesophyll cells carrying co-transformed gene can be observed as yellow fluorescence phenomenon by laser confocal microscopy,and the yellow fluorescence coincided with spontaneous red fluorescence of chloroplasts.【Conclusion】 The interaction between AGPase-bt2 and GPN1 in plant cells was confirmed.

AGPase-bt2;GPN1;bimolecular fluorescence complementation;protein interaction

2014-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170731，31200611)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130206012NY，20130102066JC)

崔喜艷(1971-)，女(達(dá)斡爾族)，吉林長(zhǎng)春人，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。 E-mail:cuixiyan2005@163.com

韓四平(1970-)，男，吉林長(zhǎng)春人，副研究員，碩士，主要從事分子標(biāo)記輔助育種研究。E-mail:13246294@qq.com

時(shí)間:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.007

Q753

A

1671-9387(2015)06-0099-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.007.html