衛(wèi)功慶，劉少華，范 寧，李 梁，趙 巖，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春130118)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化鹿角盤膠原蛋白酶解提取工藝研究

衛(wèi)功慶，劉少華，范 寧，李 梁，趙 巖，張連學(xué)

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春130118)

【目的】 采用響應(yīng)曲面法對鹿角盤膠原蛋白酶解提取工藝進(jìn)行優(yōu)化?！痉椒ā?以馬鹿鹿角盤為原料，膠原蛋白提取率為指標(biāo)，選取料液比、pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定各因素的最優(yōu)提取條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間為影響因素，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)曲面法分析4個(gè)因素對膠原蛋白提取率的影響?！窘Y(jié)果】 單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：料液比1∶20、pH值1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間為6 h時(shí)膠原蛋白提取率最高。響應(yīng)曲面法得到的最佳提取工藝為：pH 1.77、加酶量3.94%、酶解溫度36.78 ℃、酶解時(shí)間5.39 h，考慮到實(shí)際情況，對模型預(yù)測得到的馬鹿鹿角盤膠原蛋白最優(yōu)提取工藝進(jìn)行修正，修正后的工藝為：pH 1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間5 h。在此條件下，馬鹿鹿角盤膠原蛋白提取率達(dá)到83.32%。4個(gè)因素對膠原蛋白提取率影響的重要性順序?yàn)椋好附鉁囟?加酶量>pH值>酶解時(shí)間?！窘Y(jié)論】 建立了酶解法提取鹿角盤膠原蛋白的二次多項(xiàng)式模型，獲得了膠原蛋白提取率較高的最佳工藝參數(shù)，有效縮短了膠原蛋白的提取時(shí)間。

響應(yīng)曲面法；馬鹿鹿角盤；膠原蛋白；提取工藝優(yōu)化；胃蛋白酶

鹿角盤是雄性鹿科動(dòng)物馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)或梅花鹿(CervusnipponTemmick)在每年7～8月份鹿茸被割下以后自然生長出來的形狀不一、十分堅(jiān)硬的盤狀物質(zhì)，待到第二年的4～5月份自然脫落[1]。鹿角盤中含有大量的膠原蛋白，是鹿角霜、鹿角膠的原料[2]。《中國藥典:2010版一部》明確規(guī)定，鹿角為鹿科動(dòng)物馬鹿或梅花鹿已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基[3]。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，鹿角盤具有溫補(bǔ)肝腎、活血消腫、治陰癥瘡瘍、乳癰初起、淤血腫痛等功效。馬鹿角有補(bǔ)腎陽、益精血和抗疲勞及增強(qiáng)機(jī)體免疫能力的作用，另外馬鹿茸、馬鹿骨為可用于保健食品的生物資源[4]。新疆馬鹿角已被應(yīng)用于“骨密鈣”等鈣補(bǔ)充劑產(chǎn)品中，發(fā)揮其增強(qiáng)骨密度的功能和作用，由新疆特豐藥業(yè)利用天山馬鹿角研發(fā)出的防治骨質(zhì)疏松新產(chǎn)品“骨密鈣”已投入市場[5]。研究表明，馬鹿角蛋白酶解物具有抗氧化、抗疲勞和提高免疫功能的作用[6]。

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白的25%～30%，占骨骼有機(jī)物的80%以上[7]。膠原蛋白具有很強(qiáng)的伸張能力，具有增加肌膚彈性、增強(qiáng)機(jī)體皮膚組織細(xì)胞儲(chǔ)水能力以及保持皮膚細(xì)嫩、柔軟等生理功能[8]。膠原蛋白中甘氨酸的含量約占1/3；一般來說，羥脯氨酸約占膠原蛋白干質(zhì)量的14%左右，但隨組織來源、部位甚至測定方法不同其含量有所不同，如軟骨中約占10%；羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征性氨基酸，膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸含量共約占1/4，而且膠原蛋白中存在其他蛋白質(zhì)中沒有的羥基賴氨酸(Hyl)[9]。膠原蛋白廣泛存在于動(dòng)物的韌帶、肌鞘、骨、軟骨、肌腱、皮膚和筋膜中，其提取制品已廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥、保健品等眾多領(lǐng)域[10]。目前，膠原蛋白的提取方法主要有酸法、堿法、鹽法、酶法、熱水浸提法等。與酸法、堿法相比，酶法能保存原料中的有效成分，具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、無氨基酸破壞或消旋現(xiàn)象、沒有有害物質(zhì)及副產(chǎn)物產(chǎn)生，酶解過程可控等優(yōu)點(diǎn)，且酶解得到的產(chǎn)物游離氨基酸較少、多肽較多，安全性高[11]。但是，由于鹿角盤是鹿茸骨化后的產(chǎn)物，質(zhì)地非常堅(jiān)硬，不易粉碎，使鹿角盤有效成分的提取、分離較為困難，直接影響了人們對它的深入研究，因此市場上關(guān)于鹿角盤的加工制品較為罕見。為此，本試驗(yàn)以馬鹿鹿角盤為原料，采用響應(yīng)曲面法對酶解法提取鹿角盤膠原蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，以期為鹿科動(dòng)物產(chǎn)品的綜合開發(fā)和深度利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鹿鹿角盤購于遼寧省清原縣；胃蛋白酶(1∶3 000)、對二甲氨基苯甲醛、L-羥脯氨酸，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸、濃鹽酸、氯胺T、高氯酸、異丙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG628A分析電子天平，上海皖衡電子儀器有限公司生產(chǎn)；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司生產(chǎn)；PHS-W系列微機(jī)型pH計(jì)，上海般特儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，北京國華醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇市江南儀器廠生產(chǎn)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 鹿角盤粉常規(guī)成分的測定

水分測定：直接干燥法(GB 5009.3-2010)；灰分測定：馬福爐法(GB 5009.4-2010)；粗蛋白測定：凱氏定氮法(GB 5009.5-2010)；脂肪測定：索氏抽提法(GB 5009.6-2003)。

1.4 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照文獻(xiàn)[12]的方法建立羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 鹿角盤中膠原蛋白含量的測定

準(zhǔn)確稱取馬鹿鹿角盤粉100 mg至酸解管中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，抽真空充氮?dú)?，重?fù)3次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺絲蓋，將已封口的酸解管放在恒溫干燥箱內(nèi)110 ℃酸解24 h，然后取出冷卻、過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸發(fā)除去剩余的鹽酸，將樣品移入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混合均勻，即得樣品酸解液。吸取樣品酸解液1 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，混合均勻，即得樣品稀釋液。吸取樣品稀釋液1 mL，采用對二甲氨基苯甲醛比色法，在558 nm處測定吸光度。通過羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出樣品酸解液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，再乘以相應(yīng)的系數(shù)即可轉(zhuǎn)換為鹿角盤中膠原蛋白的含量。

樣品中膠原蛋白含量的計(jì)算公式：

w1=(C1×V1×F1)/(m1×106)×H×100%。

(1)

式中：w1為樣品中膠原蛋白的含量(%)；C1為樣品酸解液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)；V1為樣品酸解液的總體積(mL)；F1為樣品酸解液的稀釋倍數(shù)；H為羥脯氨酸轉(zhuǎn)換為膠原蛋白的系數(shù)，取7.1[13]；m1為樣品的質(zhì)量(g)。

1.6 鹿角盤膠原蛋白酶解法提取工藝的優(yōu)化

1.6.1 鹿角盤的酶解工藝 將馬鹿鹿角盤粉碎(過0.15 mm孔徑篩)、脫鈣，取脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉與0.5 mol/L乙酸按一定比例混合，調(diào)節(jié)體系pH值，然后加入一定量的胃蛋白酶，置于數(shù)顯水浴恒溫振蕩器中，在適宜溫度下反應(yīng)一定時(shí)間進(jìn)行酶解，反應(yīng)結(jié)束后100 ℃滅酶活10 min，雙層濾紙抽濾，得到酶促酸溶膠原蛋白(PSC)酶解液，冷凍干燥，得到酶促酸溶膠原蛋白(PSC)粉。

1.6.2 鹿角盤膠原蛋白酶解工藝的單因素試驗(yàn) 選取料液比(即原料質(zhì)量(g)與0.5 mol/L乙酸體積(mL)比)、pH值、加酶量(胃蛋白酶質(zhì)量與原料質(zhì)量比(%))、酶解溫度和酶解時(shí)間5個(gè)單因素為考察因子，膠原蛋白提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1) 料液比的確定。稱取脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉1 g(精確到0.000 1 g)，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30加入0.5 mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH值至2，加酶量4%，酶解溫度37 ℃，酶解時(shí)間6 h，100 ℃滅酶活10 min，測定提取液中的膠原蛋白含量。

2) pH值的確定。稱取脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉1 g(精確到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH值分別為1.4，1.6，1.8，2.0和2.2，加酶量4%，酶解溫度為37 ℃，酶解時(shí)間6 h，100 ℃滅酶活10 min，測定提取液中的膠原蛋白含量。

3) 加酶量的確定。稱取脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉1 g(精確到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH值至1.8，加酶量分別為1%，2%，3%，4%和5%，酶解溫度37 ℃，酶解時(shí)間6 h，100 ℃滅酶活10 min，測定提取液中的膠原蛋白含量。

4) 酶解溫度的確定。稱取脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉1 g(精確到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH值為1.8，加酶量4%，酶解溫度分別為31，33，35，37和39 ℃，酶解時(shí)間6 h，100 ℃滅酶活10 min，測定提取液中的膠原蛋白含量。

5) 酶解時(shí)間的確定。稱取脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉1 g(精確到0.000 1 g)，按料液比1∶20加入0.5 mol/L乙酸，調(diào)節(jié)pH值為1.8，加酶量4%，酶解溫度37 ℃，酶解時(shí)間分別為2，4，6，8和10 h，100 ℃滅酶活10 min，測定提取液中的膠原蛋白含量。

1.6.3 鹿角盤膠原蛋白酶解提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化 通過響應(yīng)面分析法和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)，以膠原蛋白提取率為評價(jià)指標(biāo)，確定胃蛋白酶提取鹿角盤膠原蛋白的最優(yōu)工藝條件，由于膠原蛋白提取率隨料液比變化趨勢緩慢，因此選取pH值(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)、酶解時(shí)間(D)4個(gè)因素(表1)，進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)曲面法分析其對膠原蛋白提取率的影響。

1.6.4 提取液中膠原蛋白含量的測定 取1 mL馬鹿鹿角盤膠原蛋白酶解提取液至酸解管中，加入9 mL 6 mol/L鹽酸進(jìn)行酸解后，在558 nm處測定樣品的吸光度。通過羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出酶解液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，再乘以相應(yīng)的系數(shù)即可轉(zhuǎn)換為提取液中膠原蛋白的含量。

酶解液中膠原蛋白含量的計(jì)算公式：

(2)

式中：w2為馬鹿鹿角盤粉膠原蛋白酶解液中膠原蛋白的含量(%)；C2為馬鹿鹿角盤粉膠原蛋白酶解液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)；V2為馬鹿鹿角盤粉膠原蛋白酶解液的總體積(mL)；F2為馬鹿鹿角盤粉膠原蛋白酶解液的稀釋倍數(shù)；m2為馬鹿鹿角盤粉膠原蛋白酶解液的質(zhì)量(g)。

膠原蛋白提取率的計(jì)算公式：

w=w2/w1×100%。

(3)

1.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取10 g(精確到0.000 1 g)脫鈣后的馬鹿鹿角盤粉3份，按照實(shí)際優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，按照1.6.4的方法測定馬鹿鹿角盤中膠原蛋白的提取率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理及圖表繪制采用Excel 2003及Design-Expert 8.0.4軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鹿鹿角盤粉中常規(guī)成分的含量

馬鹿鹿角盤粉中，水分含量占2.25%，灰分含量占55.05%，脂肪含量占0.20%；粗蛋白含量占41.23%，其中膠原蛋白含量為23.06%，占粗蛋白的55.93%，可見，馬鹿鹿角盤是獲取天然膠原蛋白的一條新途徑。

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸光度值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，吸光度值與羥脯氨酸質(zhì)量濃度的關(guān)系為：y=0.086 8x+0.002，R2=0.999 3。

2.3 5個(gè)單因素對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響

2.3.1 料液比的確定 由圖2可以看出，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，膠原蛋白的提取率達(dá)到最大值，為81.34%，繼續(xù)增大0.5 mol/L乙酸的用量時(shí)，膠原蛋白提取率變化幅度較小，趨于平緩，從節(jié)約成本及降低后續(xù)濃縮負(fù)荷考慮，確定最適料液比為1∶20。

2.3.2 pH值的確定 由圖3可以看出，在酶解時(shí)間及酶解溫度一定的情況下，當(dāng) pH值達(dá)到1.8時(shí)膠原蛋白的提取率達(dá)到最大值，為87.10%。當(dāng)繼續(xù)升高pH值時(shí)，膠原蛋白的提取率反而下降，這可能是由于pH值升高導(dǎo)致酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致膠原蛋白的提取率下降，由此可以確定最適pH值為1.8。

2.3.3 加酶量的確定 由圖4可以看出，膠原蛋白的提取率隨著胃蛋白酶用量的增加而升高，在胃蛋白酶用量較小的情況下，膠原蛋白提取率相對較低，這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊拿冈诟邼舛鹊牡孜镏刑幱陲柡蜖顟B(tài)。當(dāng)加酶量超過4%時(shí)，膠原蛋白提取率的增加幅度不大，由于酶的價(jià)格相對較高，考慮到節(jié)約成本問題，確定最適加酶量為4%。

2.3.4 酶解溫度的確定 由圖5可以看出，隨著酶解溫度的升高，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度為37 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最大，為85.26%，因此確定最佳酶解溫度為37 ℃。

2.3.5 酶解時(shí)間的確定 由圖6可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間在2～4 h時(shí)，膠原蛋白提取率相對較低，這可能是由于酶解時(shí)間過短，膠原蛋白未能充分釋放到提取液中。當(dāng)酶解時(shí)間為6 h時(shí)膠原蛋白提取率達(dá)到最大，為82.63%；繼續(xù)延長酶解時(shí)間，膠原蛋白提取率降低，這可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長，膠原蛋白過度水解，從而產(chǎn)生過多的苦味小分子低聚肽和氨基酸，進(jìn)而導(dǎo)致膠原蛋白的流失。因此確定最佳酶解時(shí)間為6 h。

圖5 酶解溫度對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響
Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on collagen yield from antler base

圖6 酶解時(shí)間對鹿角盤膠原蛋白提取率的影響
Fig.6 Effect of hydrolysis time on collagen yield from antler base

2.4 響應(yīng)曲面法對馬鹿鹿角盤膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化

選取pH值(A)、加酶量(B)、酶解溫度(C)、酶解時(shí)間(D)4個(gè)因素，以馬鹿鹿角盤膠原蛋白提取率(w)作為評價(jià)指標(biāo)對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

在以上29個(gè)試驗(yàn)中，7、11、17、25、29是中心試驗(yàn)，重復(fù)5次試驗(yàn)來估計(jì)試驗(yàn)誤差。利用Design Expert軟件對29個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果如表3所示。

利用Design Expert 軟件，進(jìn)行多元回歸擬合，獲得鹿角盤膠原蛋白提取率對編碼自變量pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為：

由表3可知，模型的P<0.000 1，表示該模型對試驗(yàn)結(jié)果的模擬較好；失擬項(xiàng)的P值為0.074 3，失擬項(xiàng)不顯著；說明可以用該模型對鹿角盤膠原蛋白提取工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

由表3可知，各因素之間的交互作用對膠原蛋白提取率影響的主次順序?yàn)椋簒1x2>x2x4>x1x4>x2x3>x1x3>x3x4，其中x1x2、x2x4、x1x4之間的交互作用影響達(dá)極顯著水平，x2x3之間的交互作用達(dá)顯著水平，x1x3、x3x4之間的交互作用未達(dá)顯著水平，故不做詳細(xì)分析。

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用 Design Expert軟件繪制pH值、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間對膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面圖(圖7和圖8)，對影響膠原蛋白提取率各因素效應(yīng)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

(1)主效應(yīng)分析。根據(jù)各因素的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果(表3)，可得出4因素對膠原蛋白提取率的影響主次順序依次為：酶解溫度>加酶量>pH值>酶解時(shí)間，酶解溫度、加酶量、pH值和酶解時(shí)間對膠原蛋白提取率的影響均達(dá)極顯著水平。

(2)兩因素之間的交互效應(yīng)分析。由表3可知，x1x2、x1x4、x2x4、x2x3的P值均小于0.05，即pH值和加酶量、pH值和酶解時(shí)間、加酶量和酶解時(shí)間、加酶量和酶解溫度之間的交互作用對膠原蛋白提取率的影響顯著，其響應(yīng)面圖與等高線圖如圖7和圖8所示。

等高線的形狀可以反映交互項(xiàng)影響的強(qiáng)弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。綜合圖7、圖8響應(yīng)面圖與等高線圖可以看出，當(dāng)pH值一定時(shí)，膠原蛋白提取率隨加酶量的增加及酶解時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)加酶量一定時(shí)，膠原蛋白提取率隨pH值及酶解溫度的升高、酶解時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)酶解溫度一定時(shí)，膠原蛋白提取率隨加酶量的增加呈先升高后降低的趨勢；當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí)，膠原蛋白提取率隨pH值的升高及加酶量的增加呈先升高后降低的趨勢；說明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)能夠較好地反映試驗(yàn)所設(shè)定的4個(gè)因素對膠原蛋白提取率的影響，對各因素的考察較為系統(tǒng)、全面，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

為確定最佳酶解工藝參數(shù)，對所得方程進(jìn)行逐步回歸，刪除不顯著項(xiàng)，然后求一階偏導(dǎo)，并令其為0，可得膠原蛋白提取率達(dá)到最大值時(shí)的工藝條件為：pH 1.77、加酶量3.94%、酶解溫度36.78 ℃、酶解時(shí)間 5.39 h；考慮到實(shí)際情況，將其優(yōu)化后的條件修正為，pH 1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間5 h。

注：**、*分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。x1、x2、x3、x4分別代表因素A、B、C、D。

Note:“**” and “*” mean significant difference atP<0.01 andP<0.05 respectively.x1,x2,x3,andx4indicate A,B,C,and D respectively.

圖7 pH值和加酶量的交互作用對鹿角盤膠原蛋白酶解提取率的影響
Fig.7 Interaction between pH and enzyme loading on the extraction rate of enzymatic hydrolysis of collagen from antler base

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照實(shí)際優(yōu)化的工藝條件(pH 1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間5 h)進(jìn)行試驗(yàn)，得到鹿角盤膠原蛋白提取率為83.32%，與預(yù)測值基本一致，說明通過響應(yīng)曲面法預(yù)測得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確、可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 討論與結(jié)論

隨著生活水平的提高，人們追求健康的意識(shí)逐漸加強(qiáng)，膠原蛋白的美容、保健功效越來越受到人們的青睞。膠原蛋白是鹿角盤中的主要功效成分之一，從鹿角盤中提取膠原蛋白是獲取天然膠原蛋白的一條新途徑。鹿角盤中含有豐富的膠原蛋白及多肽，臨床上，鹿角盤膠原蛋白具有治療骨質(zhì)疏松、乳腺增生等作用[14-16]。由于鹿角盤屬于骨類，質(zhì)地堅(jiān)硬，從中提取膠原蛋白一般采用高溫浸提或酒制的方法。粗提得到的膠原蛋白為明膠，低溫放置仍具有凝膠性，分子量在幾萬到十萬，不易被人體消化利用，因此需進(jìn)行酶解，酶解得到的膠原蛋白分子量在幾千到幾萬[17-19]。徐云鳳等[20]采用水提與胰蛋白酶酶解相結(jié)合的方法提取鹿角盤膠原蛋白，得出鹿角盤膠原蛋白提取率為22.31%，其中的蛋白含量為66.32%。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知：胃蛋白酶是一種消化性蛋白酶，它可以使膠原溶解，胃蛋白酶催化水解膠原的端肽非螺旋區(qū)，而對螺旋區(qū)無作用，這樣溶解的膠原仍具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，降低了膠原的抗原性，具有良好的生物相容性，而乙酸可以起到使膠原蛋白膨脹和增溶的作用[21-22]。因此本試驗(yàn)采用乙酸與胃蛋白酶相結(jié)合的方法提取鹿角盤中的膠原蛋白。

響應(yīng)曲面法已成功應(yīng)用于優(yōu)化酶催化反應(yīng)的處理?xiàng)l件，如pH值、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度等。響應(yīng)面分析法是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具，在評估有效因素和數(shù)學(xué)模型等方面能夠準(zhǔn)確描述相互作用的各獨(dú)立變量之間的相關(guān)關(guān)系，應(yīng)用該方法求得的回歸方程精度高，而且能研究幾種因素間的交互作用。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)可采用較少的時(shí)間和試驗(yàn)次數(shù)，以最經(jīng)濟(jì)的方式對多因素多水平試驗(yàn)進(jìn)行科學(xué)的、全面的研究[23-24]。李珂等[25]采用響應(yīng)曲面法對骨膠原蛋白酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出骨粉多肽生成量為121.45 mg/g。張根生等[26]采用響應(yīng)曲面法對堿性蛋白酶提取林蛙殘?bào)w膠原蛋白的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出林蛙殘?bào)w膠原蛋白提取率為 55.38%。李莉等[27]采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶法優(yōu)化了大鯢皮膠原蛋白的提取工藝，得出大鯢皮膠原蛋白提取率可達(dá)到 66.99%。因此，利用響應(yīng)面分析方法可以準(zhǔn)確找出整個(gè)區(qū)域內(nèi)因素的最佳組合以及獲得膠原蛋白提取率的最優(yōu)工藝參數(shù)。

本研究利用Design Expert軟件，應(yīng)用響應(yīng)曲面法，對馬鹿鹿角盤粉的膠原蛋白提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為：pH 1.77、加酶量3.94%、酶解溫度36.78 ℃、酶解時(shí)間5.39 h?？紤]到實(shí)際情況，將其優(yōu)化為pH 1.8、加酶量4%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間5 h，在此條件下，鹿角盤膠原蛋白的提取率達(dá)83.32%。在今后的試驗(yàn)過程中，將對鹿角盤膠原蛋白的分離、純化、理化性質(zhì)及其酶解產(chǎn)物生物活性進(jìn)一步研究，也可以考慮采用復(fù)合酶對鹿角盤進(jìn)行酶解。膠原多肽是膠原蛋白在細(xì)菌、酶或者化學(xué)的作用下分子鏈解體、斷裂之后形成的介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的產(chǎn)物，相對分子量從幾千到幾萬，它比膠原蛋白更容易被消化吸收，并且在營養(yǎng)、功能特性等方面也有十分顯著的提高。將膠原蛋白水解為膠原多肽可使其在消化吸收、營養(yǎng)、功能特性等方面都會(huì)得到顯著的提高。因此，將膠原蛋白水解為膠原多肽為下一步研究的重點(diǎn)。

[1] Wu F F,Li H Q,Jin L J,et al.Deer antler base as a traditional Chinese medicine:A review of its traditional uses,chemistry and pharmacology [J].Journal of Ethnopharmacology,2013,145(2):403-415.

[2] 鄧明魯.中國動(dòng)物藥資源 [M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:323-325.

Deng M L.Source of pharmic animal [M].Beijing:China Press of Traditional Chinese Medicine,2007:323-325.(in Chinese)

[3] 國家藥典委員會(huì).中國藥典：2010版一部 [M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

China Pharmacopoeia Committee.Chinese Pharmacopoeia 2010 edition [M].Beijing:China Medical Science Press,2010.(in Chinese)

[4] 秦 瑜,張明海.中國馬鹿的研究現(xiàn)狀及展望 [J].野生動(dòng)物雜志,2009,30(2):100-104.

Qin Y,Zhang M H.Review of researches of red deer (Cervuselaphus)and perspects in China [J].Chinese Journal of Wildlife,2009,30(2):100-104.(in Chinese)

[5] 一 文.特豐藥業(yè)用馬鹿角制成防治骨質(zhì)疏松藥 [N].醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào),2008-04-28(9).

Yi W.Special Feng pharmaceutical used horses antlers made prevention osteoporosis drug [N].Medicine Economic News,2008-04-28(9).(in Chinese)

[6] 侯 瀟,高 建,李春雨,等.馬鹿角蛋白酶解物的抗氧化抗疲勞和免疫活性 [J].食品科學(xué),2013,34(9):305-309.

Hou X,Gao J,Li C Y,et al.Antioxidant,anti-fatigue and immune function of antler (Cervuselaphus) protein and hydrolyzate [J].Food Sciences,2013,34(9):305-309.(in Chinese)

[7] 蔣挺大,張春萍.膠原蛋白 [M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006.

Jiang T D,Zhang C P.Collagen [M].Beijing:Chemical Industry Press,2006.(in Chinese)

[8] 宋 芹,陳封政,顏 軍,等.膠原蛋白研究進(jìn)展 [J].成都大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,31(1):35-38.

Song Q,Chen F Z,Yan J,et al.Research advances of collagen [J].Journal of Chengdu University:Natural Science Edition,2012,31(1):35-38.(in Chinese)

[9] 白海英,柯蕾芬,朱文赫,等.膠原蛋白應(yīng)用的研究進(jìn)展 [J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2013,34(2):133-134.

Bai H Y,Ke L F,Zhu W H,et al.Research progress of collagen application [J].Journal of Jilin Medical College,2013,34(2):133-134.(in Chinese)

[10] Matthew D,Shoulders,Ronald T,et al.Collagen structure and stability [J].Annual Review of Biochemistry,2009,78:929-958.

[11] 高 健,李 強(qiáng),呂 磊,等.馬鹿角蛋白酶解工藝研究 [J].特產(chǎn)研究,2012,34(2):12-16.

Gao J,Li Q,Lü L,et al.Studies of enzymohydrilysis condition for the production of anlter protein inCervuselaphus[J].Special Wild Economic Animal and Plant Research,2012,34(2):12-16.(in Chinese)

[12] 藍(lán)蔚青,王 川,李 燕,等.豬皮中羥脯氨酸含量的測定 [J].中國食物與營養(yǎng),2006(10):38-40.

Lan W Q,Wang C,Li Y,et al.Determination of hydroxyproline in pig skin [J].Food and Nutrition in China,2006(10):38-40.(in Chinese)

[13] 李小勇.豬肺中膠原蛋白的提取及理化特性研究 [D].重慶：西南大學(xué),2007.

Li X Y.Study on extraction and the physical and chemical properties of pork lung collagen [D].Chongqing:Southwest University,2007.(in Chinese)

[14] 劉 盟,馬 玉,馮 崴,等.新疆馬鹿角提取物對 MC3T3-E1成骨細(xì)胞 RANKL/OPG mRNA表達(dá)的影響 [J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(6):605-609.

Liu M,Ma Y,Feng W,et al.Invitroeffects of the extracts from the Xinjiang cornuCervielaphion RANKL/OPG mRNA expression in MC3T3-E1 osteoblasts [J].Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology,2011,22(6):605-609.(in Chinese)

[15] Dorothée D,Hervé B,Anne B,et al.Carbon and nitrogen isotopic composition of red deer (Cervuselaphus) collagen as a tool for tracking palaeo environmental change during the Late-Glacial and Early Holocene in the northern Jura (France) [J].Palaeogeography,Palaeoclimatology,Palaeoecology,2003,195(3/4):375-388.

[16] Gomez S,Garcia A J,Luna S,et al.Labeling studies on cortical bone formation in the antlers of red deer (Cervuselaphus) [J].Bone,2013,52(1):506-515.

[17] Li Y Q,Zhao Y,Tang R N,et al.Prevention and therapeutic effect of Sika Deer Velvet collagen hydrolysate on osteoporosis in ovariectomized rats [J].Natural Product Research and Development,2010,22:578-581.

[18] Takeshi N,Nobutaka S,Yasuhiro T,et al.Collagen from tendon of Yezo Sika deer (Cervusnipponyesoensis) as by-product [J].Food and Nutrition Sciences,2012,3:72-79.

[19] Byongtae J,Sungjin K,Sangmoo P,et al.Effect of antler grow-th period on the chemical composition of velvet antler in sika deer (Cervusnippon) [J].Mammalian Biology,2008,74(5):374-380.

[20] 徐云鳳,趙 雨,張 鶴,等.酶解法制備鹿角盤膠原蛋白的工藝 [J].食品研究與開發(fā),2011,32(1):13-16.

Xu Y F,Zhao Y,Zhang H,et al.Study on preparation technology of trypsin hydrolytic collagen from antler plate [J].Food Research and Development,2011,32(1):13-16.(in Chinese)

[21] 鄭明強(qiáng),李新文,仇宏偉,等.從雞骨中提取骨膠原的酶解工藝研究 [J].煙臺(tái)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與工程版,2010,23(2):161-164.

Zheng M Q,Li X W,Qiu H W,et al.The technology research of enzymatic extraction of collagen from poultry bone [J].Journal of Yantai University:Natural Science and Engineering Edition,2010,23(2):161-164.(in Chinese)

[22] 陳麗麗,程 丹,趙 利,等.乙酸與胃蛋白酶提取鰻魚骨膠原蛋白工藝的研究 [J].食品科技,2011,36(4):163-166.

Chen L L,Cheng D,Zhao L,et al.The extraction of collagen from eel bone using acetic acid and pepsin [J].Food Science and Technology,2011,36(4):163-166.(in Chinese)

[23] Fang X B,Xie N N,Chen X E,et al.Optimization of antioxidant hydrolysate production from flying squid muscle protein using response surface methodology [J].Food and Bioproducts Processing,2012,90:676-682.

[24] Karina D M,Ana M R.Pilosof.Relative viscoelasticity of soy protein hydrolysate and polysaccharides mixtures at cooling conditions analyzed by response surface methodology [J].Food Hydrocolloids,2012,26:318-322.

[25] 李 珂,楊秀華,扈 麟,等.響應(yīng)曲面法骨膠原蛋白酶解條件的優(yōu)化 [J].食品科學(xué),2009,30(7):135-140.

Li K,Yang X H,Hu L,et al.Optimization of enzymatic hydrolysis conditions of pig bone collagen by response surface methodology [J].Food Sciences,2009,30(7):135-140.(in Chinese)

[26] 張根生,范愛月,韓 冰,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化堿性蛋白酶提取林蛙殘?bào)w膠原蛋白 [J].食品科學(xué),2011,32(2):93-96.

Zhang G S,Fan A Y,Han B,et al.Response surface optimization of alkaline protease hydrolysis for collagen extraction fromRanaamurensisboulenger residue after oil extraction [J].Food Sciences,2011,32(2):93-96.(in Chinese)

[27] 李 莉,顧賽麒,王錫昌,等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取大鯢皮膠原蛋白工藝 [J].中國水產(chǎn)科學(xué),2013,20(4):876-883.

Li L,Gu S Q,Wang X C,et al.Optimization of conditions for the extraction of pepsin-soluble collagen from the skin of Chinese giant salamander (Andriasdavid-ianus) [J].Journal of Fishery Sciences of China,2013,20(4):876-883.(in Chinese)

Optimization of extracting technology for enzymatic hydrolysis of collagen from antler base ofCervuselaphususing response surface methodology

WEI Gong-qing,LIU Shao-hua,FAN Ning,LI Liang,ZHAO Yan,ZHANG Lian-xue

(CollegeofChineseMedicineMaterial,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 Extracting technology of collagen from antler base ofCervuselaphuswas optimized using response surface methodology.【Method】 Taking antler base ofCervuselaphusas material and collagen extraction rate as index,the effects of material-liquid rate,pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time on collagen yield were investigated by single factor experiments and the optimal condition of each factor was determined.Then,a four-factor and three-level Box-Behnken design coupled with response surface analysis was carried out to investigate the effects of pH value,enzyme loading,hydrolysis temperature,and hydrolysis time on collagen extraction rate.【Result】 Single factor experiments showed that the highest extraction yield was obtained when material-liquid rate,pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time were 1∶20,1.8,4%,37 ℃ and 6 h,respectively.The optimal condition pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time were 1.77,3.94%,36.78 ℃ and 5.39 h determined by response surface methodology.Considering the actual situations,the obtained optimal extracting methods for collagen production from antler base had pH,enzyme loading,hydrolysis temperature and hydrolysis time of 1.8,4%,37 ℃,and 5 h.Under the optimal conditions,collagen extraction rate from antler base was 83.32%.The importance of four factors to the extraction of collagen was in the order of hydrolysis temperature>enzyme loading>pH value>hydrolysis time.【Conclusion】 The extracting technology of antler collagen with pepsin enzymatic hydrolysis was optimized.A quadratic regression equation model was established and the optimum procedure parameters of enzymatic hydrolysis of collagen were obtained,which effectively shortened extraction time.

response surface methodology;antler base ofCervuselaphus;collagen;optimization of extracting technology;pepsin

2013-12-23

吉林省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(08sys-097)

衛(wèi)功慶(1966-)，男，安徽六安人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究。E-mail:wgq6611@126.com

張連學(xué)(1955-)，男，吉林大安人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥學(xué)研究。E-mail:zlx863@163.com

時(shí)間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.024

R284.2

A

1671-9387(2015)06-0205-10

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.024.html