何恒流,蔡宇良,高天翔,李 彬,宛 甜,王 玉

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100)

陜西7個毛櫻桃自然居群遺傳多樣性的SSR評價

何恒流,蔡宇良,高天翔,李 彬,宛 甜,王 玉

(西北農林科技大學 園藝學院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究陜西野生毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性，為科學保存和利用陜西野生毛櫻桃資源提供理論依據?！痉椒ā?以陜西野生毛櫻桃的7個自然居群140份樣本為材料，用SSR分子標記技術研究其遺傳多樣性和遺傳結構?！窘Y果】 用10對SSR引物從7個毛櫻桃自然居群中共檢測出92個等位基因，各引物擴增的條帶在6～14個。居群多態(tài)位點比率(PPL)為100%,Shannon’s 信息指數(I)平均值為1.280，Nei’s 基因多樣性指數(H)平均值為0.655，可觀察雜合度(Ho)平均值為0.584，期望雜合度(He)平均值為0.672，表明陜西7個毛櫻桃自然居群具有較高的遺傳多樣性水平。居群的基因分化系數Fst=0.181，表明陜西野生毛櫻桃的遺傳變異主要存在于居群(81.9%)內，遺傳分化居群內高于居群間，基于Fst測得基因流Nm為1.128。利用UPGMA對7個毛櫻桃自然野生居群進行聚類，可以分為3類：麟游(LY)、繡房(XF)、華陰(HY)、哭泉(KQ)歸為第1類，小峪(XY)為第2類，鸚鴿(YG)和青化(QH)歸為第3類?！窘Y論】 李屬植物SSR引物在毛櫻桃上能夠有效的轉移利用，陜西毛櫻桃自然居群具有較高的遺傳多樣性水平，其中華陰居群遺傳多樣性水平最高，遺傳分化居群內高于居群間，7個居群可聚為3大類。

野生毛櫻桃；SSR；遺傳多樣性；遺傳結構

根據中國植物志分類，毛櫻桃(Prunustomentosa,2n=16)隸屬薔薇科李屬櫻亞屬[1]，原產于中國，以野生為主，具有極強的抗寒性及較強的抗旱、抗瘠薄能力，毛櫻桃在園藝生產上已經得到廣泛運用。野生毛櫻桃在陜西山區(qū)廣泛分布，但果實風味差異很大，有些還十分鮮美[2]。由于人為等因素的影響，一些山區(qū)的野生毛櫻桃資源瀕臨滅絕。通過分子生物學技術研究陜西野生毛櫻桃種質資源遺傳多樣性水平及居群遺傳結構，對科學有效制定野生毛櫻桃資源保護策略、收集野生優(yōu)良毛櫻桃種質資源、豐富和改良現有栽培品種都具有重要意義。

過去對于毛櫻桃的研究集中于形態(tài)、生理學等領域[3-4]，也有利用SSR分子標記技術對部分地區(qū)毛櫻桃群體進行研究的報道[5]。SSR分子標記技術具有多態(tài)信息含量高、重復性好和呈共顯性的特點，已被廣泛用于櫻亞屬植物居群的遺傳分析[6-8]。張琪靜[9]就北方5個省收集的44份毛櫻桃進行SSR分析，驗證了種與種之間引物的轉移利用，與近緣種聚類分析時，毛櫻桃獨自聚為一組。宛甜等[5]就秦嶺部分毛櫻桃居群做SSR分析，發(fā)現秦嶺毛櫻桃遺傳多樣性較為豐富。陜西野生毛櫻桃種質資源豐富，對其居群比較全面的研究尚未見報道。為此，本試驗利用SSR分子標記技術對陜西野生毛櫻桃7個居群140份毛櫻桃材料進行了遺傳多樣性和居群遺傳結構分析，以期充分了解陜西野生毛櫻桃居群的種質資源信息，為中國野生毛櫻桃資源的有效保存和合理利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2013年5-7月，根據國內有關植物標本館(室)記載，以及走訪地方有關研究人員了解相關資料后，在陜西省選取7個具有代表性的地點對野生毛櫻桃資源的生存現狀進行了野外調查，根據自然居群現有分布規(guī)模對每個居群以“株”為單位隨機取樣，樣本間距離大于50 m，采集幼葉立即放入裝有干燥硅膠的自封塑料袋中干燥、備用。采集樣本共140份歸屬7個居群，詳見表1。

1.2 DNA提取和SSR-PCR

樣本DNA提取采用改進的3×CTAB 提取法[10]，利用紫外分光光度計和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和品質，稀釋至40 ng/μL,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

SSR-PCR反應體系共10 μL,包含0.2 mmol/L引物0.6 μL，30～60 ng DNA 模板，5 μL PCR MIX混合液(康維公司)。其反應程序為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 30 s，58～54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，8 ℃保存。

本試驗所選擇的120對SSR引物選自在李屬的櫻桃、桃、李和杏上已見報道[11-18]的引物，根據居群規(guī)模從7個居群中隨機取樣 20 份用于引物篩選，通過SSR-PCR擴增，最終選出了條帶清晰、重復性好、穩(wěn)定性高的10對引物(表2)，以對140份毛櫻桃材料進行進一步分析。將所有材料的擴增產物(2 μL)在1×TBE緩沖液中于恒定功率(50 W)下，用12%聚丙烯酰胺凝膠分離2 h，終止電泳，銀染顯色，照相保存。

1.3 數據分析

根據擴增片段分子量大小對擴增結果進行條帶分析，所得擴增片段純合子記為“AA或BB”，雜合子記為“AB”[19]。所得數據用POPGENE32軟件進行分析，獲得可用于評價居群遺傳多樣性的指標，包括多態(tài)位點比率(PPL)、可觀察等位基因數(A)、有效等位基因數(Ae)、Shannon’s 信息指數(I)、Nei’s基因多樣性指數(H)、可觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)；以及反映居群遺傳結構的指標，包括萊特固定指數(Fis)、種群間基因分化系數(Fst)、基因流(Nm)、遺傳相似度(GI)、Nei’s遺傳距離(GD)等。根據遺傳相似度和Nei’s遺傳距離，采用非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析，并且在Nei’s遺傳距離的基礎上繪制居群聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SSR引物對陜西7個毛櫻桃居群的擴增結果

從120對引物中共篩選出10對條帶清晰、重復性好的引物，各引物擴增所得可觀察等位基因數為6～14(表2)，均有豐富擴增。引物篩選結果顯示，來自桃的引物轉移率最高，達35%，來自李的引物轉移率最低，為15%。圖1為引物Pchcms4在華陰居群上的擴增電泳結果。

圖1 引物Pchcms4對華陰毛櫻桃居群的擴增產物
M.DNA 標準分子量;1～20.華陰居群(HY)1～20號單株
Fig.1 Amplified products of Huayin population ofPrunustomentosausing primer Pchcms4
M.50 bp DNA Marker;1-20.The samples of Huayin population(HY)

2.2 陜西7個毛櫻桃居群的遺傳多樣性

由表3可知，10對引物在陜西7個毛櫻桃居群間擴增豐富，各居群多態(tài)位點比率為100%。在居群水平上，可觀察等位基因數(A)、有效等位基因數(Ae)、Shannon’s信息指數(I)、Nei’s基因多樣性指數(H)均值分別為4.929，3.340，1.280和0.655。Nei’s基因多樣性指數(H)是衡量居群遺傳多樣性最常用的指標,據此可知陜西7個毛櫻桃居群遺傳多樣性水平從大到小依次為HY>KQ>XY>XF>QH>YG>LY。

2.3 陜西7個毛櫻桃居群的遺傳結構

由表4可知，陜西7個毛櫻桃自然居群的種群間基因分化系數(Fst)為0.104～0.236，居群間的平均基因分化系數為0.181，這說明毛櫻桃居群81.9%的遺傳分化存在于居群內，18.1%的遺傳分化存在于居群間，表明陜西野生毛櫻桃遺傳變異主要存在于居群內。基于Fst測得基因流(Nm)為1.128。由萊特固定指數(Fis)可知，除UDP96-008、UDP98-025、UCD-CH31為負值外，其他引物均為正值，說明缺乏或存在過多的純合子。除UDP96-008、UDP97-403、UDP98-025位點外，居群在其他位點均偏離 Hardy-Weinberg 平衡(P< 0.05)，其表現為可觀察雜合度明顯低于期望雜合度。

2.4 陜西7個毛櫻桃居群的聚類結果

基于陜西7個毛櫻桃居群間的遺傳距離(表5)，采用 UPGMA 法進行聚類分析，進一步直觀分析居群間的遺傳關系，結果如圖2所示。由圖2可知，在遺傳距離為0.6(圖中虛線所示位置)時，陜西7個毛櫻桃居群可歸為3大類：其中麟游(LY)、繡房(XF)、華陰(HY)與哭泉(KQ)居群歸為一類，小峪(XY)居群歸為第2類，鸚鴿(YG)和青化(QH)居群歸為第3類。由圖2還可看出，麟游(LY)與繡房(XF)居群的親緣關系最近，與青化(QH)居群的親緣關系最遠。

注：表中右上為遺傳相似度，左下為遺傳距離。

Note:Above diagonal is genetic identity while below diagonal is genetic distance.

3 討 論

3.1 SSR引物的擴增

本試驗從120對李屬植物引物中篩選出10對擴增條帶清晰、穩(wěn)定的引物，其中來自桃的引物表現出較高的轉移率，達35%，而李的引物在毛櫻桃中表現出較低的轉移率，僅為15%，此研究結果與張琪靜[9]的研究結果相似。引物UDP96-001、UCD-CH31在陜西7個毛櫻桃居群上擴增的可觀察等位基因數均高于其在土耳其野生甜櫻桃上的擴增數(12∶6，9∶4)[20]。同樣是在毛櫻桃上，本研究中引物UDP96-001、UCD-CH31擴增的可觀察等位基因數也比Zhang等[10]的研究結果略高(12∶5，9∶4)。黃磊等[21]認為，引物擴增情況與研究對象有關，并在一定范圍內隨居群個體數增多，引物擴增的可觀察等位基因數增加。

3.2 陜西毛櫻桃居群的遺傳多樣性

本研究比較全面地對陜西野生毛櫻桃居群進行了遺傳多樣性分析。其Shannon’s 信息指數(I)平均為1.280，Nei’s 基因多樣性指數(H)平均為0.655，與近緣物種相比，高于同屬于李屬的杏[22]、馬哈利[23]以及同是薔薇科的新疆野蘋果[24]，表明陜西野生毛櫻桃居群的遺傳多樣性水平較高。秦偉等[25]認為，新疆野生蘋果通過種子實生繁殖等一套固有的繁殖體系來維持種群的繁殖，從而保持了其較高的遺傳多樣性水平。毛櫻桃自花結實能力很強，以實生繁殖為主，供試7個居群材料豐富、分布廣泛，而且有些居群就位于秦嶺巴山的多樣性中心，這可能是導致陜西野生毛櫻桃居群遺傳多樣性水平較高的主要原因。

3.3 陜西毛櫻桃居群的遺傳結構

居群遺傳結構是遺傳變異在時間、空間上的分布式樣，是突變、基因流、選擇和遺傳漂變共同作用的結果，用來揭示居群內部的分布格局。遺傳分化是反映遺傳結構的重要指標。本研究中7個毛櫻桃居群的基因分化系數Fst=0.181，表明陜西野生毛櫻桃的遺傳變異主要存在于居群內(81.9%)，遺傳分化居群內高于居群間。在對與毛櫻桃相近物種的相關研究中也有一致的結果[5，9]。基因流是影響居群遺傳分化的重要因素，Loveless等[26]認為，當居群間基因流大于1時，基因流起到均質化作用。本研究中7個毛櫻桃居群的基因流Nm=1.128>1，表明基因流可能是引起毛櫻桃居群間遺傳分化的重要因素。對于野生毛櫻桃居群而言，由于各居群地理位置距離較遠，導致居群的開花期不同，以及山脈的阻隔，都影響了毛櫻桃居群間的基因交流。蔡宇良[27]認為，種子散布機制對居群間的遺傳分化有顯著影響，中國櫻桃主要依靠動物消化系統(tǒng)傳播種子，其種子流受到動物活動范圍的制約。據此推測，在陜西山區(qū)復雜的地理環(huán)境下，以野生毛櫻桃果實為生的鳥獸可能是影響毛櫻桃居群遺傳結構的重要因素。

野生毛櫻桃資源在陜西山區(qū)雖然分布廣泛，但此次野外實地考察發(fā)現，此類野生資源遭受人為破壞的現象嚴重，部分地區(qū)的野生毛櫻桃資源瀕臨滅絕，因此有必要加強野生毛櫻桃資源的保護。本研究中7個居群的遺傳變異主要存在于居群內，而居群間遺傳分化系數較大，所以在重點保護遺傳多樣性豐富的野生居群時應兼顧不同地理區(qū)域居群。在7個自然居群中，華陰(HY)居群遺傳多樣性水平最高，因此，在利用和保護陜西野生毛櫻桃種質資源時，可以優(yōu)先考慮華陰(HY)居群。

4 結 論

利用10對SSR引物對陜西7個野生毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性進行了分析，結果表明，李屬植物SSR引物在毛櫻桃上能夠有效的轉移利用，7個毛櫻桃自然居群的遺傳多樣性水平豐富，其中華陰居群遺傳多樣性最高，居群內遺傳分化高于居群間。通過聚類分析，可將7個居群聚為3類。

[1] 俞德浚.中國植物志:第 38 卷 [M].北京:科學出版社,1986.

Yu D J.Flora reipubicae popularis sinicae:Tomus 38 [M].Beijing:Science Press,1986.(in Chinese)

[2] 張亮成,羅耀祖,楊永林.陜西秦巴山區(qū)的野生果樹種質資源 [J].園藝學報,1993,20(1):27-32.

Zhang L C,Luo Y Z,Yang Y L.Wild fruit resources in Qinba mountain district of Shaanxi province [J].Acta Horticulturae Sinica,1993,20(1):27-32.(in Chinese)

[3] Kalju Kask.The tomentosa cherry,PrunustomentosaThunb [J].Fruit Varieties Journal,1989,43(2):51-59.

[4] 高海生,肖月娟,劉秀鳳,等.毛櫻桃果實營養(yǎng)成分分析研究 [J].食品科學,2002,23(6):110-112.

Gao H S,Xiao Y J,Liu X F,et al.Study on fruit nutritive compositions ofPrunustomentosa[J].Food Science,2002,23(6): 110-112.(in Chinese)

[5] 宛 甜,蔡宇良,馮 瑛,等.野生毛櫻桃SSR遺傳多樣性和遺傳結構分析 [J].西北植物學報，2013，33(8)：1544-1550.

Wan T,Cai Y L,Feng Y,et al.Genetic diversity and genetic structure of wildPrunustomentosaThub.using simple sequence repeats markers [J].Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2013,33(8):1544-1550.(in Chinese)

[6] Yoshiaki T,Madoka K,Shuri K,et al.Genetic structure ofCer-asusjamasakura,a Japanese flowering cherry,revealed by nuclear SSRs:Implications for conservation [J].Journal of Plant Research,2009,122(4):367-375.

[7] Mariette S,Tavaud M,Arunyawat U,et al.Population structure and genetic bottleneck in sweet cherry estimated with SSRs and the gametophytic self-incompatibility locus [J].BMC Genetics,2010,11:77.

[8] 陳 嬌,王小蓉,湯浩茹,等.基于SSR標記的四川野生中國櫻桃遺傳多樣性和居群遺傳結構分析 [J].園藝學報,2013,40(2):333-340.

Chen J,Wang X R,Tang H R,et al.Assessment of genetic diversity and populations genetic structure in wild Chinese cherry from Sichuan Province using SSR markers [J].Acta Horticulturae Sinica,2013,40(2):333-340.(in Chinese)

[9] 張琪靜.毛櫻桃資源遺傳多樣性及與李屬近緣種親緣關系的研究 [D].沈陽:沈陽農業(yè)大學,2007.

Zhang Q J.Studies onP.tomentosagenetic diversity and relationships with relative species inPrunus[D].Shenyang:Shenyang Agricultural University,2007.(in Chinese)

[10] Zhang Q J,Yan G J,Dai H Y,et al.Characterization of Tomentosa cherry (PrunustomentosaThunb.) genotypes using SSR markers and morphological traits [J].Hort Sci,2008,118(1):39-47.

[11] Dirlewanger E,Cosson P,Tavaud M,et al.Development of mic-rosatellite markers in peach [Prunuspersica(L.) Batsch] and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry (PrunusaviumL.) [J].Theoretical and Applied Genetics,2002,105(1):127-138.

[12] Mnejja M,Garcia-Mas J,Howad W,et al.Simple-sequence repeat (SSR) markers of Japanese plum (PrunussalicinaLindl.) are highly polymorphic and transferable to peach and almond [J].Molecular Ecology Notes,2004,4(2):163-166.

[13] Decroocq V,Fave M G,Hagen L,et al.Development and tran-sferability of apricot and grape EST microsatellite markers aross taxa [J].Theor Appl Genet,2003,106:912-922.

[14] Cantini C,Iezzoni A F,Lamboy W F,et al.DNA fingerprinting of the tetraloid cherry germplasm using simple sequence repeats [J].J Am Soc Hortic Sci,2001,126:205-209.

[15] Sosinski B,Gannavarap M,Hager L D,et al.Characterization of microsatellite markers in peach [Prunuspersica(L.) Batsch.] [J].Theor Appl Genet,2000,101:421-428.

[16] Cipriani G,Lot G,Huang W G,et al.AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunuspersica(L)Batsch]:Isolation,characterisation and cross-species amplification inPrunus[J].Theor Appl Genet,1999,99:65-72.

[17] Testolin R,Marrazzo T,Cipriani G,et al.Microsatellite DNA in peach [Prunuspersica(L.)Batsch] and its use in fingerpinting and testing the genetic origin of cultivars [J].Genome,2000,43:512-520.

[18] Struss D,Ahmad R,Sourthwick S M,et al.Analysis of sweet cherry (PrunusaviumL.) cultivars using SSR and AFLP markers [J].Journal of the American Society for Horticultural Science,2003,128(6):904-909.

[19] Wang L,Guo J,Zhao G F.Genetic diversity of the endangered and endemic speciesPsathyrostachyshuashanicanatural populations using simple sequence repeats (SSRs) markers [J].Biochemical Systematics and Ecology,2006,34(4):310-318.

[20] Ercisli S,Agar G,Yildirim N,et al.Genetic diversity in wild sweet cherries (Prunusavium) in Turkey revealed by SSR markers [J].Genet Mol Res,2011,10(2):1211-1219.

[21] 黃 磊,王義權.微衛(wèi)星分子標記在瀕危動物保護遺傳學研究中的應用 [J].生物多樣性,2004,12(5):528-533．

Huang L,Wang Y Q.The application of microsatellite DNA markers in conservation genetics of endangered animals [J].Biodiversity Science,2004,12(5):528-533.(in Chinese)

[22] He T M，Chen X S，Xu Z,et al.Using SSR markers to determine the population genetic structure of wild apricot(PrunusarmeniacaL.)in the Ily Valley of west China [J].Genetic Resources and Crop Evolution,2007,54(3):563-572.

[23] Jordano P，Godoy J A.RAPD variation and population genetic structure inPrunusmahaleb(Rosaceae)，an animal-dispersed tree [J].Molecular Ecology,2000,9(9):1293-1305.

[24] 張春雨,陳學森,林 群,等.新疆野蘋果居群遺傳結構和遺傳多樣性的SRAP分析 [J].園藝學報,2009,36(1):7-14.

Zhang C Y,Chen X S,Lin Q,et al.SRAP markers for population genetic structure and genetic diversity inMalussieversiifrom Xinjiang,China [J].Acta Horticulturae Sinica,2009,36(1):7-14.(in Chinese)

[25] 秦 偉,沙 紅,劉立強,等.新疆野蘋果資源遺傳多樣性SSR分析 [J].果樹學報,2012,29(2):161-165.

Qin W,Sha H,Liu L Q,et al.SSR analysis for genetic diversity ofMalussieversiifrom Xinjiang,China [J].Journal of Fruit Science,2012,29(2):161-165.(in Chinese)

[26] Loveless M D,Hamrick J L.Ecological determinants of genetic structure in plant populations [J].Annual Reviews of Ecology and Systematics,1984,15:65-95.

[27] 蔡宇良.野生櫻桃種質資源的遺傳分析及其栽培品種的DNA指紋鑒定 [D].西安:西北大學,2006.

Cai Y L.Genetic analysis of the wild cherry germplasm and identification of cultivated cherry varities using DNA fingerprints [D].Xi’an:Northwest University,2006.(in Chinese)

SSR evaluation of genetic diversity of seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi

HE Heng-liu,CAI Yu-liang,GAO Tian-xiang,LI Bin,WAN Tian,WANG Yu

(CollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated the genetic diversity of wildPrunustomentosapopulations to provide theoretic reference for utilization and conservation of thus resources in Shaanxi.【Method】 A total of 140 samples from seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi were collected to study genetic diversity and genetic structure using SSR markers.【Result】 A total of 92 alleles of 10 loci were detected from seven wildPrunustomentosapopulations and the number of alleles per locus ranged from 6 to 14.The percentage of polymorphic loci (PPL) was 100% in populations.The mean Shannon’s information index (I),Nei’s gene diversity (H),observed heterozygosity (Ho),and expected heterozygosity (He)were 1.280,0.655,0.584 and 0.672,respectively.The results revealed that the genetic diversity in the wildPrunustomentosaof the 7 populations in Shaanxi was rich. About 81.9% of (Fst=0.181) gene differentiation was observed within the populations,higher than among populations.According to gene differentiation coefficient,the gene flow (Nm) was 1.128.Based on un-weighted pair-group method, the seven wildPrunustomentosapopulations in Shaanxi were divided into three groups:group one included LY,XF,HY,and KQ,group two included XY,and group three contained YG and QH.【Conclusion】 Genetic diversity in the wildPrunustomentosain Shaanxi was rich,and that of HY population was the richest.The genetic differentiation within each population was higher than among populations.And the 7 populations were divided into 3 groups.

Prunustomentosa;SSR;genetic diversity;genetic structure

2014-07-11

“十二五”國家科技計劃項目(2013BAD02B00)；唐仲英果樹育種基金項目(2009YZ033)

何恒流(1989-)，男，安徽合肥人，在讀碩士，主要從事櫻桃育種與種質資源研究。E-mail:526610925@qq.com

蔡宇良(1964-)，男，陜西寶雞人，教授，主要從事果樹育種與栽培研究。E-mail:cylxlcz0673@sina.com

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.021

S662.501

A

1671-9387(2015)06-0193-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.021.html