劉妮妮，劉雅莉，婁 倩，楊慧萍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，b 林學(xué)院，c 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

葡萄風信子外植體直接再分化花芽和營養(yǎng)芽的研究

劉妮妮a,b，劉雅莉a,b，婁 倩a,c，楊慧萍a,b

(西北農(nóng)林科技大學(xué) a 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，b 林學(xué)院，c 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 探索葡萄風信子直接再生花芽體系的建立，為葡萄風信子外植體直接再分化花芽研究提供參考?！痉椒ā?以葡萄風信子‘亞美尼亞’花蕾外植體為材料，MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在均添加0.1 mg/L 2,4-D 的條件下，分別用不同質(zhì)量濃度的6-BA(0，0.5，1，2，3，4 mg/L)、GA3(0，0.5，1，2，3，4 mg/L)和玉米素(0，0.05，0.1，0.5，1，2 mg/L)處理，篩選出誘導(dǎo)花芽的最佳激素及最適質(zhì)量濃度；以MS+6-BA(或玉米素)2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L研究開花時花瓣切片、花葶、葉片以及葉片誘導(dǎo)的愈傷組織誘導(dǎo)直接再分化花芽的情況?！窘Y(jié)果】 用MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D處理葡萄風信子花蕾時，可在花蕾基部直接再分化出具有藍色的花芽，且花芽分化率最高，達 60.2%?；ㄝ恪⒒ò昵衅⑷~片和愈傷組織在同樣條件下只能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織、營養(yǎng)芽。說明花蕾是誘導(dǎo)花芽分化的最佳外植體，且最適培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D?！窘Y(jié)論】 建立了葡萄風信子外植體直接再分化花芽體系。

葡萄風信子‘亞美尼亞’；直接再分化花芽；營養(yǎng)芽；組織培養(yǎng)

葡萄風信子(Muscari)是一種多年生春季球根花卉，屬于天門冬科風信子亞科葡萄風信子屬。葡萄風信子花期較長，其花序小而精致，花色呈現(xiàn)特殊的藍色，其繁殖方式主要是以退化的鱗莖進行無性繁殖。此外，葡萄風信子是異花授粉植物，其總狀花序通常由頂端的不育花和中下部的可育花組成?？捎閮尚曰?，雌雄同體，其既能在蜜蜂等昆蟲的幫助下接受異花的花粉，少數(shù)情況也能通過自花授粉正常繁殖后代[1]。一些品種還存在明顯的不育性狀，如葡萄風信子‘白魔術(shù)’(M.aucheri‘White Magic’)。部分瀕危品種如漸變葡萄風信子(M.latifolium)和天藍葡萄風信子(M.azureum)等的鱗莖在自然條件下幾乎不產(chǎn)生子球或產(chǎn)生子球的速度非常緩慢[2]。目前對該屬物種的快繁和保護主要依靠組織培養(yǎng)技術(shù)，針對許多品種的葡萄風信子材料已先后建立了較成熟的快繁體系，如M.racemosum[3]、M.macrocarpum[4]、M.aucheri[5]、M.azureum[6]、M.mirium[7]和M.muscarimi[2]；關(guān)于利用愈傷組織[8-9]和原生質(zhì)體構(gòu)建再生體系[10]也有一些報道，但是有關(guān)葡萄風信子直接再分化花芽的研究尚未見報道。葡萄風信子的40多個種展現(xiàn)出不同程度的藍色[11]，為研究單子葉植物藍色花形成機理提供了理想的材料。但是通常情況下從播種到實生苗開花至少需要3年的時間，生長周期較長，這在一定程度上限制了對植物基因功能驗證工作的進展，從而限制了利用分子生物技術(shù)進行花色育種的進展。

植物外植體直接再生花芽是在離體條件下誘導(dǎo)外植體經(jīng)歷脫分化和再分化過程后形成花器官。已有報道稱在布羅瓦利亞花[12]、石龍芮[13]、大蒜[14]、矮通泉草[15]等植物的愈傷組織中得到了無葉花芽的直接分化。外植體能否再分化出花芽與其自身的發(fā)育、營養(yǎng)組分及激素的種類和用量有密切的關(guān)系，且在其他條件相同的情況下，激素的種類和用量起著決定性的作用。本研究利用葡萄風信子‘亞美尼亞’花蕾、花葶、花瓣和幼葉為材料，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，研究外源激素6-BA、GA3、玉米素用量及其與2,4-D配比對這些材料誘導(dǎo)產(chǎn)生營養(yǎng)芽和花芽的影響，以期為葡萄風信子外植體直接再分化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以葡萄風信子‘亞美尼亞’(Muscariarmeniacum)為材料，于2014-03取材于西安植物園，并種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)種質(zhì)資源圃。分別采集盛花期不同花序部位的花蕾及花葶、花瓣和幼葉。

1.2 方 法

1.2.1 材料消毒和培養(yǎng) 將所取材料先用自來水沖洗干凈，體積分數(shù)75% 酒精浸泡30 s后，用質(zhì)量分數(shù)0.1% 升汞(氯化汞，HgCl2)消毒，花蕾和花瓣切片消毒5 min，花葶和幼葉消毒10 min，然后用無菌水沖洗4次，待用?；ɡ俸陀鷤M織(由MS+0.6 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生)直接接種到誘花培養(yǎng)基，花葶和幼葉切成1 cm大小的切塊后再分別接入誘花培養(yǎng)基，花瓣中間縱切成兩半接種。接種后的材料放入白天(20±2) ℃，夜晚(20±1) ℃的環(huán)境中培養(yǎng)，28～30 d轉(zhuǎn)接一次。分別于添加不同外源激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔5 d將培養(yǎng)物從三角瓶中取出，在連續(xù)變倍實體顯微鏡(SMZ1500)下拍照記錄其外觀形態(tài)變化。

1.2.2 6-BA對花蕾花芽和營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的6-BA進行處理，6-BA質(zhì)量濃度設(shè)置為0，0.5，1，2，3 和4 mg/L，同時加入2,4-D 0.1 mg/L。各處理的培養(yǎng)基為蔗糖30 g/L，植物凝膠3 g/L，pH 5.8。對照組為不添加任何激素的空MS。花蕾培養(yǎng)在內(nèi)盛30 mL培養(yǎng)基的玻璃瓶中，使用透氣封口膜封口。培養(yǎng)50 d后，觀察記錄從花蕾上直接分化花芽的分化率。

1.2.3 GA3對花蕾花芽和營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的GA3進行處理，GA3質(zhì)量濃度設(shè)置為0，0.5，1，2，3和4 mg/L，同時加入2,4-D 0.1 mg/L。各處理的培養(yǎng)基為蔗糖30 g/L，植物凝膠3 g/L，pH 5.8。對照組為不添加任何激素的空MS?；ɡ倥囵B(yǎng)在內(nèi)盛30 mL 培養(yǎng)基的玻璃瓶中，使用透氣封口膜封口。培養(yǎng)50 d后，觀察記錄從花蕾上直接分化花芽的分化率。

1.2.4 玉米素(ZT)對花蕾花芽和營養(yǎng)芽誘導(dǎo)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的玉米素，玉米素質(zhì)量濃度設(shè)置為0，0.05，0.1，0.5，1 和2 mg/L，同時加入2,4-D 0.1 mg/L。各處理的培養(yǎng)基為蔗糖30 g/L，植物凝膠3 g/L，pH 5.8。對照組為不添加任何激素的空MS?；ɡ倥囵B(yǎng)在內(nèi)盛30 mL培養(yǎng)基的玻璃三角瓶中，用透氣封口膜封口。培養(yǎng)50 d后，觀察記錄從花蕾上直接分化花芽的分化率。

1.2.5 外植體誘導(dǎo)花芽和營養(yǎng)芽的比較 以MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D和MS+2 mg/L玉米素+0.1 mg/L 2,4-D為培養(yǎng)基，培養(yǎng)供試花蕾、花瓣、花葶、幼葉及誘導(dǎo)的愈傷，60 d 后觀察其誘導(dǎo)組織情況。

1.2.6 分化率的計算 誘導(dǎo)形成花芽(營養(yǎng)芽、根)分化率=誘導(dǎo)形成花芽(營養(yǎng)芽、根)的外植體數(shù)/所培養(yǎng)的外植體總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄風信子花芽和營養(yǎng)芽發(fā)生的形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1 花 芽 觀察結(jié)果顯示，不同發(fā)育時期的葡萄風信子花蕾外植體在附加2 mg/L 6-BA，0.1 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上，只有含苞待放的花蕾可以在其基部直接再生花芽(圖1-A，B)，其他類型的花蕾都出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象。離體培養(yǎng)5～40 d 的花蕾培養(yǎng)物在連續(xù)變倍實體顯微鏡下所觀察到的形態(tài)變化如圖1-D-I所示。外植體接種5～10 d，花蕾基部和花葶、葉片切口處都可以形成愈傷組織(圖1-D)，這些愈傷組織進一步發(fā)育形成白色或綠色的原基狀突起(圖1-E，F(xiàn))。培養(yǎng)20 d后，原基進一步長大并且有顏色形成(圖1-G)。25 d后，隨著進一步發(fā)育，花芽已長到肉眼可見，幾片扁平狀結(jié)構(gòu)合起來形成花蕾(圖1-H)。40 d后，扁平狀合起來形成的花蕾顏色進一步加深，頂端開裂，成簇的花芽向外翻卷(圖1-I)。對照組花蕾內(nèi)子房逐漸膨大(圖1-C)。

2.1.2 營養(yǎng)芽 葡萄風信子外植體在附加6-BA和2,4-D的MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)營養(yǎng)芽和愈傷組織的發(fā)生(圖2-A-I)。培養(yǎng)1周后花葶、葉片和花瓣切片邊緣均有愈傷組織形成，且愈傷組織表面光滑稍透明；培養(yǎng)時間稍長還可以在外植體表面形成類似的體表愈傷組織。觀察這2種愈傷組織的特點發(fā)現(xiàn)，其均呈腫脹狀，因此統(tǒng)稱為腫脹狀愈傷組織。這些愈傷組織在進一步培養(yǎng)以后表面逐漸形成許多頂端稍尖的獨立個體，完全不透明的乳白色個體為營養(yǎng)芽原基，同時還具有綠色的不定芽(圖2-B)。乳白色原基進一步生長可形成幼葉，幼葉迅速伸長，頂部由乳白色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\綠色，葉形呈管狀(圖2-E)。管狀幼葉進一步伸長和加粗，除基部還保持白色外其余部分由淺綠色轉(zhuǎn)為深綠色。初代培養(yǎng)2個月后即成為具有小鱗莖的幼苗(圖2-F)。

2.2 外源激素對葡萄風信子再分化花芽和營養(yǎng)芽的影響

為了探索外源激素對離體培養(yǎng)再分化花芽的影響，以葡萄風信子花蕾為外植體進行試驗，在培養(yǎng)基中均添加0.1 mg/L 2,4-D,培養(yǎng)50 d后，觀察記錄從花蕾上直接分化花芽的分化率(表1)。表1結(jié)果表明，單獨使用2,4-D進行處理只能誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生。向培養(yǎng)基中添加6-BA，且6-BA質(zhì)量濃度小于0.5 mg/L時，培養(yǎng)的花蕾上無花芽形成，只有愈傷組織和營養(yǎng)芽。在1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D 培養(yǎng)基上，既有營養(yǎng)芽也有花芽，且花芽分化率為37.3%；在2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基上，花芽分化率最高，達60.2%。進一步計算比較可以看出，當6-BA質(zhì)量濃度大于2 mg/L 時，營養(yǎng)芽和花芽分化率均有隨6-BA質(zhì)量濃度升高而下降的趨勢，且分化的花芽和營養(yǎng)芽均不正常，經(jīng)常呈畸形或玻璃狀。當培養(yǎng)基中添加GA3時，任何質(zhì)量濃度梯度中都至少有80%的花蕾外植體分化形成愈傷組織，1 mg/L GA3+0.1 mg/L 2,4-D為花蕾愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，但無營養(yǎng)芽和花芽形成。玉米素和2,4-D配合使用時，外植體只能誘導(dǎo)形成愈傷組織，當玉米素質(zhì)量濃度高于0.1 mg/L時，愈傷誘導(dǎo)率為100%。

注：2,4-D 0.1 mg/L，培養(yǎng)50 d后，觀察記錄從花蕾上直接再生花芽和不定芽的頻率(被污染的材料未統(tǒng)計在內(nèi))；數(shù)值代表3次重復(fù)的平均值。

Note:2,4-D 0.1 mg/L,calculated on the 50 day after young floral buds were culturedinvitro(The contaminated explants were not calculated).Each value represents the mean of 3 replications.

2.3 葡萄風信子不同器官外植體直接再分化花芽

從表1可以看出，花蕾外植體在 MS+6-BA 2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出花芽，且花芽分化率最高。因此，為了弄清從其他器官上分離的外植體對再分化花芽的影響，選用MS+6-BA 2 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L培養(yǎng)基對不同器官上分離的外植體進行試驗，進一步探討葡萄風信子各種器官再生花芽的能力；同時以玉米素2 mg/L和2,4-D 0.1 mg/L的培養(yǎng)基對不同器官上分離的外植體進行試驗。結(jié)果(表2)表明，在附加6-BA 2 mg/L和2,4-D 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，只有花蕾可以誘導(dǎo)形成花芽，幼葉、花葶、花瓣切片和愈傷組織都只能誘導(dǎo)再分化營養(yǎng)芽和愈傷組織。玉米素2 mg/L和2,4-D 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上，所有外植體都只能再分化營養(yǎng)芽或愈傷組織。

3 討論與結(jié)論

迄今為止，在葡萄風信子中已經(jīng)清楚了誘導(dǎo)胚狀體、營養(yǎng)芽和根再分化生長素和細胞分裂素的最佳配比[2,16]，但對花芽分化的誘導(dǎo)尚未見報道，在其他植物中雖然已有花芽分化的報道[17]，但進展不大。從所用的外源激素來看，基本上是KT(kinetin)或6-BA與IAA的不同配比。Goh[18-19]研究表明，6-BA可以促進雜種石斛蘭整體植株的花芽發(fā)端，誘導(dǎo)花芽發(fā)生。同時一些研究者發(fā)現(xiàn)，適當質(zhì)量濃度的6-BA能夠促進植物的花芽分化，但當質(zhì)量濃度過高或過低時則抑制花芽分化[20]。可見，不同質(zhì)量濃度的6-BA對花芽分化的影響不同，在使用細胞分裂素時應(yīng)選擇合適的質(zhì)量濃度。

本研究通過對葡萄風信子‘亞美尼亞’進行組織培養(yǎng)，探討了不同外植體和外源激素對其離體培養(yǎng)直接再生花芽的影響，結(jié)果表明，當6-BA質(zhì)量濃度為2 mg/L時，只有花蕾外植體能誘導(dǎo)直接再分化花芽；GA3和玉米素不能誘導(dǎo)花芽。研究結(jié)果還表明，MS培養(yǎng)基中僅附加2,4-D只能誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織；附加玉米素則能誘導(dǎo)外植體再分化直接形成愈傷組織；附加GA3只能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；附加一定比例的6-BA與2,4-D除能誘導(dǎo)營養(yǎng)芽外，還能誘導(dǎo)形成大量具有藍色的不正?；ㄑ?。

試驗中誘導(dǎo)葡萄風信子除花蕾外的外植體產(chǎn)生不正常花芽，經(jīng)過2次繼代后長成畸形花芽。造成此結(jié)果的原因可能有兩種：一是高質(zhì)量濃度6-BA促進花芽分化，抑制其正常開花；二是葡萄風信子屬于球根花卉，自然狀態(tài)下是在夏季花芽分化并經(jīng)過一段時間的低溫春化處理后才正常開花，而本試驗中植物材料沒有經(jīng)過低溫處理，因此只有花蕾外植體才能誘導(dǎo)出花芽，其他外植體尚需進一步研究。

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Direct regenerated floral and vegetative buds from explants ofMuscariarmeniacum

LIU Ni-nia,b,LIU Ya-lia,b,LOU Qiana,c,YANG Hui-pinga,b

(aStateKeyLaboratoryofCropStressBiologyinAridAreas,MinistryofAgricultureKeyLaboratoryofHorticulturalPlantBiologyandGermplasmInnovation,bCollegeofForestry,cCollegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The study investigated the optimal tissue culture conditions forMuscariarmeniacumto directly induce the regeneration of floral buds.【Method】 Floral buds explants ofM.armeniacumwere used as materials.With 0.1 mg/L 2,4-D,the buds were treated with different concentrations of 6-BA(0,0.5,1,2,3,4 mg/L),GA3(0,0.5,1,2,3,4 mg/L)and ZT (0,0.05,0.1,0.5,1,2 mg/L),respectively to select the optimal induction conditions for bud differentiation.Using MS+2 mg/L 6-BA(or ZT)+0.1 mg/L 2,4-D,effects of different explants including young floral bud,petal segment,pedicel,young leaf and callus on the optimal induction conditions of flower bud were also studied.【Result】 The optimal induction conditions for bud differentiation were MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D.The optimal induction explant was floral bud with induction rate of 60.2%.With the same hormones conditions,pedicel,sliced petals,leaf and callus explants can only be induced to form callus and vegetative buds.So the optimal induction explant is floral buds,optimal induction condition is MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D.【Conclusion】 Optimal culture system forM.armeniacumto directly induce the bud differentiation was established.

Muscariarmeniacum;direct regeneration of floral buds;vegetative buds;tissue culture

2014-09-08

國家自然科學(xué)基金項目(31170652)

劉妮妮(1989-)，女，陜西榆林人，在讀碩士，主要從事園林植物分子育種研究。E-mail:15191461927@163.com

劉雅莉(1960-)，女， 陜西西安人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事園林植物遺傳育種研究。E-mail:lyl6151@126.com

時間:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.020

S682.2+9

A

1671-9387(2015)06-0187-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.020.html