張 洋綜述，張小明，劉 剛審校

（1.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院放射科 644000；2.醫(yī)學影像四川省重點實驗室，四川南充637000）

噬菌體展示技術(shù)是一項特殊的基因重組表達技術(shù)，亦是一種強大的篩選工具。1985年，Smith等成功地創(chuàng)立了噬菌體展示技術(shù)；1990年，Scott等在噬菌體展示技術(shù)的基礎上發(fā)展并構(gòu)建了噬菌體展示隨機肽庫。噬菌體肽庫技術(shù)是一種新興的藥物發(fā)現(xiàn)工具［1］，通過噬菌體隨機肽庫篩選獲得的肽可以作為分子載體運載藥物，起到生物導彈的功能。篩選的肽也可以直接與藥物靶點分子特異性結(jié)合，起到生物治療的作用。近年來，噬菌體肽庫技術(shù)已廣泛應用于腫瘤研究，如癌癥的檢測和診斷、腫瘤相關(guān)抗原的篩選、腫瘤藥物的研制、腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導及腫瘤的基因治療研究等。現(xiàn)就近年來噬菌體展示肽庫技術(shù)在篩選腫瘤靶向短肽研究中的應用綜述如下。

1 噬菌體展示肽庫

目前，常用于噬菌體展示的噬菌體有2 種類型：（1）M13線性噬菌體；（2）T7噬菌體。噬菌體展示肽庫是把隨機短肽片段與噬菌體的P3或P8基因的N 端進行融合，通過展示技術(shù)讓隨機短肽得以獨立表達并具有生物學功能。噬菌體肽庫構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是得到足夠多的能獨立表達多肽的單克隆噬菌體，以便于靶標的結(jié)合與識別。篩選的結(jié)果受多個因素的影響，而合理地應用篩選方法是能得到高特異性、高親和力多肽的最重要的環(huán)節(jié)。

2 噬菌體隨機肽庫技術(shù)篩選腫瘤靶向短肽的研究

由于傳統(tǒng)的化療藥對腫瘤細胞的選擇精度較差，易產(chǎn)生較大的不良反應，因此，腫瘤的藥物靶向治療尤為重要。利用能與腫瘤組織特異性結(jié)合的分子作為載體，將藥物導向腫瘤組織，這種方法可以顯著提高藥物導向的準確度。根據(jù)抗原抗體反應的特異性，利用單克隆抗體為載體的藥物導向治療已成功地應用于腫瘤。但這種療法的效果并不理想，主要的原因是由于抗體相對分子質(zhì)量較大，使其應用效果降低。研究表明，噬菌體肽庫篩選系統(tǒng)提供的載體由于其具有相對分子質(zhì)量較小、穩(wěn)定性好、活性高等優(yōu)點，能較大程度上彌補單克隆抗體療法的不足［2］，因而廣泛應用于腫瘤的診斷與治療的研究中。噬菌體隨機展示肽庫篩選技術(shù)在腫瘤導向治療研究中的應用主要有4個方面：（1）篩選腫瘤親和短肽，與標識劑結(jié)合后用于腫瘤療效的評價，為下一步診療計劃提供幫助；（2）篩選的腫瘤特異肽與各種化療藥物耦聯(lián)，進而用于腫瘤的藥物導向治療研究；（3）獲得與腫瘤特異性結(jié)合的氨基酸序列后與基因片段進行耦聯(lián)，用于腫瘤的基因治療的研究；（4）篩選腫瘤相關(guān)黏附分子的特異性結(jié)合短肽，用于抑制腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的研究。腫瘤導向治療最為重要的步驟是特異性載體的構(gòu)建與選擇。目前，在篩選肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤靶向短肽的研究中，已取得一定的成果。

2.1 肺癌靶向短肽的篩選 目前，肺癌靶向短肽的篩選靶標主要為肺癌細胞和肺癌高表達的蛋白。He等［3］利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選出了能與肺癌H460細胞株特異性結(jié)合的環(huán)七肽（CSNIDARAC），實驗證明此肽能在肺部腫瘤組織中集聚而在正常組織中量少，故有望用于肺癌的顯像與治療；潘雪刁等［4］從隨機噬菌體肽庫中篩選到了能與人肺癌NCI-H1299細胞高親和力結(jié)合的多肽ZS-5，但此肽在活體中的功能有待進一步鑒定。此外，馮文彬等［5］利用噬菌體肽庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)了17個與肺癌相關(guān)的腫瘤基因，為肺癌的早期診斷提供了一定的依據(jù)。利用噬菌體肽庫技術(shù)能篩選出阻斷腫瘤發(fā)生的信號通路的短肽。據(jù)報道，非小細胞肺癌患者的不良預后與神經(jīng)菌毛素1（NRP1）有關(guān)。據(jù)此，Hong等［6］從噬菌體肽庫中篩選的多肽DG1和DG2能阻抑NRP1的表達，進而有望改善非小細胞肺癌患者的不良預后。

2.2 胃癌靶向短肽的篩選 腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌患者最主要的死因之一，阻斷胃癌細胞的腹膜轉(zhuǎn)移將極大地提高患者生存率。Bai等［7］篩選的多肽SMSIASPYIALE能夠特異性地靶向胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的組織，并且可以明顯抑制荷瘤鼠體內(nèi)胃癌GC9811-P細胞的黏附、浸潤及腹膜轉(zhuǎn)移。Zhang等［8］用噬菌體隨機十二肽庫對健康者胃黏膜上皮細胞株GES-1 和胃腺癌細胞株BGC823進行減性輪選，獲得了與胃癌特異性結(jié)合的多肽AADNAKTKSFPV（AAD），它能區(qū)分胃癌與正常的胃黏膜，并且有作為胃癌早期診斷探針的潛力。此外，多耐藥性仍然是臨床藥物治療胃癌的重要挑戰(zhàn)。據(jù)此，Kang等［9］篩選出了能與胃癌多耐藥性細胞特異性結(jié)合的短肽GMBP1（ETAPLSTMLSPY），通過體外和體內(nèi)藥物敏感性測定法、流式細胞儀分析和蛋白免疫印跡法實驗表明多肽GMBP1辨認出了一種新型葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）受體介導的多耐藥性表型，進而對于胃癌細胞多耐藥性的研究及了解胃癌細胞的相關(guān)活動提供了新的路徑。

2.3 肝癌靶向短肽的篩選 Zhang等［10］從噬菌體隨機7 肽庫中獲得了特異性的短肽序列FQHPSFI，經(jīng)實驗表明人工固相法合成的多肽FQHPSFI能與肝癌細胞高親和力結(jié)合。王昆侖等［11］采用肝癌患者血清與噬菌體隨機12肽庫進行輪選，經(jīng)過3輪的吸附-洗脫-擴增的淘篩過程后，得到的3個特異性的噬菌體克隆有望為肝癌的特異性診斷試劑提供載體，而Zhang等［12］用30例早期原發(fā)性肝細胞肝癌患者血清進行篩選并得到多肽HC1（RGWCRPLPKGEG），實驗表明此模擬肽對早期原發(fā)性肝細胞肝癌具有高的診斷效度，有望成為早期原發(fā)性肝癌的血清生物標志物。在肝癌靶向短肽的篩選中，研究者不僅進行了噬菌體隨機肽庫的體外篩選，還創(chuàng)新性地進行了活體動物的體內(nèi)篩選。Du等［13］將噬菌體隨機12文庫注入人源肝癌BEL7402細胞株的荷瘤裸鼠模型體內(nèi)進行篩選，最終獲得了與肝癌組織高親和力結(jié)合的短肽。但有學者認為，體內(nèi)篩選辦法更適合淘選與腫瘤血管內(nèi)皮細胞特異性結(jié)合的肽段［14］。

2.4 結(jié)腸癌靶向短肽的篩選 腫瘤抗原作為腫瘤的標志物已逐漸受到人們的廣泛重視。研究表明腫瘤相關(guān)糖蛋白72（TAG-72）高表達于許多類型的腫瘤中。據(jù)此，Rusckowski等［15］利用噬菌體隨機展示肽庫技術(shù)淘選出了能與TAG-72高親 和 力 結(jié) 合 的 2 肽 段 NLIWCRKEFARCTSDM 和NPGTCKD-KWIECLLNG，經(jīng)實驗表明，它們能特異性地結(jié)合到荷瘤鼠的TAG-72陽性表達的結(jié)腸癌瘤塊中。因此，這2條肽段有希望用于結(jié)腸癌的影像診斷，是否適用于其他TAG-72陽性表達腫瘤的影像診斷有待進一步探究。細胞黏合素C 高表達于結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤等大多數(shù)實體腫瘤中。Kim 等［16］從噬菌體肽庫中篩選出與細胞黏合素C 特異性結(jié)合的短肽能減少細胞黏合素C 介導的細胞增殖與遷移。Hsiung等［17］以結(jié)腸腺癌細胞為靶標進行淘選并得到能與之結(jié)合的特異性七肽（VRPMPLQ）。此肽經(jīng)熒光標記實驗檢測發(fā)現(xiàn)，它可以與結(jié)腸癌細胞結(jié)合，且不能與正常組織細胞結(jié)合，故此肽段有助于結(jié)腸癌的早期診斷。

2.5 前列腺癌靶向短肽的篩選 前列腺癌細胞的特異性抗原為前列腺癌靶向短肽的篩選提供了路徑。Shen等［18］利用噬菌體肽庫技術(shù)，以固化的前列腺特異性膜抗原蛋白為靶分子，從隨機十五肽庫中篩選到高親和力的多肽SHSFSVGSGDHSPFT 和GRFLTGGTGRLLRIS，經(jīng)細胞熒光顯微鏡觀察這些多肽能靶向人前列腺癌的特異性膜抗原，獲得的多肽有望用于前列腺腫瘤的顯像與治療。成纖維細胞生長因子8b（FGF8b）是表達在前列腺癌的成纖維細胞生長因子8的主要同型，它與疾病的分期及評分有關(guān)。Wang等［19］從噬菌體隨機肽庫中篩選出與FGF8b特異性結(jié)合的多肽P12（HSQAAVP），實驗表明此肽是FGF8b的拮抗劑，故有治療前列腺癌的潛力。Fagbohun等［20］以轉(zhuǎn)移性的前列腺癌PC-3M 細胞株為靶標進行篩選，最終從噬菌體隨機肽庫中獲得了高親和力的噬菌體顆粒EPTHSWAT（展示在噬菌體表面的特定序列）。此特異性的噬菌體顆粒被修飾后能選擇性地作用于PC-3M 細胞并且能表達綠色熒光蛋白基因，故這種類噬菌體顆粒有望用于前列腺癌的治療基因的靶向傳遞，為靶向藥物的設計提供了實驗依據(jù)。

2.6 其他腫瘤靶向短肽的篩選 據(jù)報道，酪氨酸蛋白激酶（c-Met）的異常表達與大多數(shù)種類的腫瘤有關(guān)。Zhao等［21］利用噬菌體隨機肽庫技術(shù)淘選到與c-Met高親和力結(jié)合的序列為YLFSVHWPPLKA 的多肽Met-pep1，實驗表明此肽具有抑制人平滑肌肉瘤細胞生長增殖的功能。Sun 等［22］篩選的多肽EDIKPKTSLAFR 經(jīng)示蹤劑跟蹤實驗后表明此多肽復合物能靶向鼻咽癌組織，故有望用于鼻咽癌的診斷。此外，喉癌、宮頸癌、胰腺癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等靶向短肽的篩選均有文獻報道。也有研究者直接以腫瘤干細胞表面標記物為靶標進行淘選［23］，總之，噬菌體肽庫技術(shù)已廣泛地應用于腫瘤靶向肽的篩選。

2.7 腫瘤血管靶向肽的篩選 腫瘤血管內(nèi)皮細胞與其他器官或組織的血管內(nèi)皮細胞所處的微環(huán)境有差異，這種差異為噬菌體隨機多肽在體內(nèi)的特異性選擇提供了條件。此外，針對腫瘤血管內(nèi)皮細胞表達而正常血管內(nèi)皮細胞不表達的受體，亦有望找到腫瘤導向治療的靶點。Kelly等［24］以血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1（VCAM-1）蛋白為靶分子，利用噬菌體展示肽庫技術(shù)淘選出能與VCAM-1特異性結(jié)合的多肽（VHSPNKK）。實驗發(fā)現(xiàn)，此肽與納米顆粒耦聯(lián)的復合物能與表達VCAM-1的腫瘤血管內(nèi)皮細胞高親和力結(jié)合；而無此多肽序列的復合物則對腫瘤血管細胞沒有親和力。Qin等［25］根據(jù)人血管內(nèi)皮生長因子受體3（VEGFR-3）高表達于大多數(shù)腫瘤，從噬菌體隨機肽庫中篩選到能與表達VEGFR-3 的腫瘤特異性結(jié)合的短肽CSDSWAYWC，此肽有望成為腫瘤導向治療的載體。此外，Zanuy等［26］篩選的五肽CREKA 亦能與腫瘤血管特異性結(jié)合。由于從噬菌體肽庫中獲得的特異性短肽能靶向腫瘤血管內(nèi)皮細胞，進而導向腫瘤，故將其與顯像劑、藥物等耦聯(lián)起來，既可以早期地診斷腫瘤，又可以在顯著抑制腫瘤生長的同時，高效地減少傳統(tǒng)化療藥的不良反應。目前，能與高表達于腫瘤新生血管的整合素αvβ3特異性結(jié)合的西侖吉肽在治療膠質(zhì)瘤的應用中已完成了Ⅲ期臨床試驗，但試驗以失敗告終。通過篩選腫瘤血管特異性結(jié)合肽來靶向治療腫瘤的路徑雖好，但仍面臨免疫原性、腫瘤細胞異質(zhì)性、患者間的差異性等問題。

3 結(jié) 語

通過噬菌體肽庫技術(shù)獲得的多肽被修飾后可作為藥物運輸?shù)妮d體、成像的探針或兼兩者為一體的多功能的納米顆粒，這種納米顆粒具有更強的腫瘤穿透能力，更高負荷的藥物運載能力，更多的成像信息及較低的毒性［27-28］。用噬菌體肽庫技術(shù)獲得的靶向載體雖優(yōu)點繁多，但要使得從肽庫中獲得的短肽正式應用于臨床還要克服很多困難。該技術(shù)今后要解決的問題主要有以下幾方面：（1）盡量增加肽庫的多樣性；（2）盡量降低多肽的免疫原性；（3）盡量提高噬菌體的轉(zhuǎn)染率；（4）進一步提高展示多肽的靶向性；（5）如何在篩選過程中盡量減少對靶分子或靶細胞的天然構(gòu)象的影響。該技術(shù)在腫瘤方面的應用目前還主要處在實驗研究階段，故獲得能用于臨床的高效的腫瘤靶向短肽任重道遠。隨著噬菌體展示肽庫技術(shù)的發(fā)展和完善，其在腫瘤靶向載體的研究領(lǐng)域必將會帶來更大的推動作用。

［1］ Fukuda MN.Peptide-displaying phage technology in glycobiology［J］.Glycobiology，2012，22（3）：318-325.

［2］ Lauven RH，Krumpe，Mori T.The use of phage-displayed peptide librariesto develop tumor-targeting drugs［J］.Int J Pept Res Ther，2006，12（1）：79-91.

［3］ He XF，Na MH，Kim JS，et al.A novel peptide probe for imaging and targeted delivery of liposomal doxorubicin to lung tumor［J］.Mol Pharm，2011，8（2）：430-438.

［4］ 潘雪刁，何冰，王桂香，等.肺癌特異性結(jié)合多肽的體外篩選和鑒定［J］.中國藥理學通報，2013，29（3）：342-346.

［5］ 馮文彬，潘雪刁，周捷，等.利用肺癌特異性結(jié)合多肽ZS-6篩選肺癌相關(guān)標志物［J］.中國藥理學通報，2010，26（1）：44-47.

［6］ Hong TM，Chen YL，Wu YY，et al.Targeting neuropilin 1as an antitumor strategy in lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2007，13（16）：4759-4768.

［7］ Bai F，Liang J，Wang J，et al.Inhibitory effects of a specific phage displayed peptide on high peritoneal metastasis of gastric cancer［J］.J Mol Med，2007，85（2）：169-180.

［8］ Zhang WJ，Sui YX，Budha A，et al.Affinity peptide developed by phage display selection for targeting gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2012，18（17）：2053-2060.

［9］ Kang J，Zhao G，Lin T，et al.A peptide derived from phage display library exhibits anti-tumor activity by targeting GRP78in gastric cancer multidrug resistance cells［J］.Cancer Lett，2013，339（2）：247-259.

［10］ Zhang B，Zhang Y，Wang J，et al.Screening and identification of a targeting peptide to hepatocarcinoma from a phage display peptide library［J］.Mol Med，2007，13（5／6）：246-254.

［11］ 王昆侖，賀海平.噬菌體隨機12肽庫篩選肝癌患者血清腫瘤標記物的初步研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2010，18（6）：1075-1076.

［12］ Zhang Z，Xu L，Wang Z.Screening serum biomarkers for early primary hepatocellular carcinoma using aphage display technique［J］.J Clin Lab Anal，2011，25（6）：402-408.

［13］ Du B，Yu J，Zhou ZL，et al.Selection of the peptides specifically binding to hepatoma by using phage display in vivo［J］.Zhong Hua Zhong Liu Za Zhi，2005，27（11）：645-647.

［14］ Li XB，Schluesener HJ，Xu SO，et al.Molecular addresses of tumors：selection by in vivo phage display［J］.Arch Immunol Ther Exp，2006，54（3）：177-181.

［15］ Rusckowski M，Gupta S，Liu G，et al.Evidence of specificity of radiolabeled phage display peptides for the TAG-72antigen［J］.Cancer Biother Radiopharm，2007，22（4）：564-572.

［16］ Kim MY，Kim OR，Choi YS，et al.Selection and characterization of tenascin C targeting peptide［J］.Mol Cells，2012，33（1）：71-77.

［17］ Hsiung PL，Hardy J，F(xiàn)riedland S，et al.Detection of colonic dysplasiain vivousing a targeted heptapeptide and confocal microendoscopy［J］.Nat Med，2008，14（4）：454-458.

［18］ Shen D，Xie F，Edwards WB.Evaluation of phage display discovered peptides as ligands for prostate-specific membrane antigen（PSMA）［J］.PLoS One，2013，8（7）：1-8.

［19］ Wang W，Chen X，Li T，et al.Screening aphage display library for a novel FGF8b-binding peptide with antitumor effect on prostate cancer［J］.Exp Cell Res，2013，319（8）：1156-1164.

［20］ Fagbohun OA，Kazmierczak RA，Petrenko VA，et al.Metastatic prostate cancer cell-specific phage-like particles as a targeted gene-delivery system［J］.J Nanobiotechnology，2013，11：31.

［21］ Zhao P，Grabinski T，Gao C，et al.Identification of ametbinding peptide from a phage display library［J］.Clin Cancer Res，2007，13（20）：6049-6055.

［22］ Sun L，Chu T，Wang Y，et al.Radiolabeling and biodistribution of a nasopharyngeal carcinoma-targeting peptide identified byin vivophage display［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2007，39（8）：624-632.

［23］ Sun J，Zhang C，Liu G，et al.A novel mouse CD133binding-peptide screened by phage display inhibits cancer cell motility in vitro［J］.Clin Exp Metastasis，2012，29（3）：185-196.

［24］ Kelly KA，Allport JR，Tsourkas A，et al.Detection of vascular adhesion molecule-1expression using a novel multimodal nanoparticle［J］.Circ Res，2005，96（3）：327-336.

［25］ Qin X，Wan Y，Li M，et al.Identification of a novel peptide ligand of human vascular endothelia growth factor receptor 3for targeted tumor diagnosis and therapy［J］.J Biochem，2007，142：79-85.

［26］ Zanuy D，F(xiàn)lores-Ortega A，Casanovas J，et al.Energy landscape of a selective tumor-homing pentapeptide［J］.J Phys Chem B，2008，112（29）：8692-8700.

［27］ Banerjee D，Harfouche R，Sengupta S.Nanotechnologymediated targeting of tumor angiogenesis［J］.Vasc Cell，2011，3（1）：3.

［28］ Namiki Y，F(xiàn)uchigami T，Tada N，et al.Nanomedicine for cancer：lipid-based nanostructures for drug delivery and monitoring［J］.Acc Chem Res，2011，44（10）：1080-1093.