陳春琳，劉 祥，俱 雄

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK的原核表達及多克隆抗體制備

陳春琳，劉 祥，俱 雄

(陜西理工學院 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001)

【目的】 構(gòu)建溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核表達載體，優(yōu)化OmpK蛋白的誘導表達條件，制備OmpK蛋白小鼠多克隆抗體。【方法】 通過PCR擴增獲得ompK基因，連接pET-32a質(zhì)粒構(gòu)建OmpK-pET32a載體，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后進行誘導表達。利用切膠純化獲得OmpK蛋白后，免疫小鼠制備OmpK蛋白多克隆抗體，采用ELISA法檢測抗體效價，Western-Blotting法檢測抗血清特異性。通過正交試驗，獲得OmpK菌株的最佳誘導表達條件與培養(yǎng)條件。【結(jié)果】 PCR擴增獲得了長816 bp的ompK基因；成功構(gòu)建了OmpK-pET32a載體，其誘導表達產(chǎn)物分子質(zhì)量為30 ku，與預期結(jié)果一致。ELISA法獲得OmpK抗血清效價達1∶1 600，Western-Blotting試驗證實抗血清具有很好的特異性。OmpK菌株最佳誘導表達條件為：菌液OD600值0.8，IPTG終濃度0.3 mmol/L，誘導時間8 h，誘導溫度32 ℃；最佳培養(yǎng)條件為：不添加葡萄糖，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50 mL?！窘Y(jié)論】 成功制備了OmpK蛋白多克隆抗體，確定了OmpK蛋白菌株的最佳誘導表達條件與培養(yǎng)條件。

溶藻弧菌；OmpK蛋白；原核表達；多克隆抗體

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)為革蘭氏陰性菌，分布于海域、河口地區(qū)，可引起水產(chǎn)魚類敗血癥和胃腸炎，造成大量死亡，嚴重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1-2]；它也可引起人類胃腸道疾病與傷口感染，是一種人和海洋動物共感染的病原菌[3]。

外膜蛋白(Outer membrance proteins,OMPs)是弧菌外膜結(jié)構(gòu)的重要組成部分，在感染和誘導宿主免疫反應中起重要作用[1]。試驗證實不同種類的弧菌存在多種交叉保護的外膜蛋白抗原[4]，在疫苗的開發(fā)中受到人們關注[5]。其中外膜蛋白OmpK(Outer membrance protein K)是弧菌細胞表面的一種組成型蛋白，位于弧菌細胞壁外膜的外層, 與外界存在廣泛的接觸，為弧菌的主要表面抗原之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)，OmpK蛋白氨基酸序列在不同弧菌間具有保守性，存在交叉免疫反應，是弧菌間共同抗原的分子基礎[7]。OmpK免疫原性已在大黃魚和點帶石斑等海水養(yǎng)殖魚類中得到驗證[8]。此外，OmpK對弧菌感染具有很好的免疫保護作用[9-10]。李梅芳等[11]利用殼聚糖、海藻酸鈉包裹副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)OmpK蛋白，成功制備免疫性較好的口服制劑；鄭磊等[12]通過構(gòu)建副溶血弧菌OmpK與鞭毛蛋白的融合蛋白，制備腸溶口服微球疫苗，取得一定的免疫保護效果。可見，OmpK作為水產(chǎn)疫苗有很好的應用前景[13-14]。

本試驗構(gòu)建了溶藻弧菌OmpK蛋白原核表達載體，利用SDS-PAGE電泳切膠方法純化OmpK蛋白，并用OmpK蛋白免疫小鼠，制備小鼠OmpK抗血清，通過正交試驗確定OmpK蛋白表達菌株最適的表達條件與培養(yǎng)條件，為溶藻弧菌OmpK蛋白工業(yè)發(fā)酵與疫苗開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和試驗動物 溶藻弧菌、大腸桿菌(E.coli)BL21和DH5α菌株及pET-32a質(zhì)粒，均由陜西理工學院生化與分子實驗中心保存；7只4～5周齡的雄性昆明鼠購于西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑Taq酶、限制性內(nèi)切酶、T4-DNA 連接酶、DNA Marker和蛋白標樣，均為Takara 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，均為上海生物工程公司產(chǎn)品；IPTG、蛋白胨和酵母粉，購于美國MP公司；HRP標記山羊抗小鼠二抗，購于Sigma公司；引物合成由西安沃爾森生物技術有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 方 法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI公布的溶藻弧菌ompK基因序列(GenBank登錄號：FJ176400.1)，采用Primer 5軟件設計ompK基因引物：Primer 1，5′-ACAGGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3′；Primer 2:5′-ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3′，Primer 1和Primer 2中下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶位點BamHⅠ和XhoⅠ。PCR反應體系為50 μL：反應緩沖液5 μL，溶藻弧菌(OD600約2.0)菌株3 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L(Primer 1和Primer 2)引物各1.5 μL，Taq酶0.5 μL，補水至50 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR片段大小。將PCR產(chǎn)物和pET-32a質(zhì)粒載體分別進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，通過T4-DNA連接酶將目的基因插入pET-32a質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取重組質(zhì)粒后進行BamHⅠ和XhoⅠ 雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒測序由西安沃爾森生物技術有限公司完成，最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21表達菌株。

1.2.2 蛋白的表達檢測與純化 取重組大腸桿菌BL21菌株過夜培養(yǎng)，以1∶100(體積比)轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600約為0.6時，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG，37 ℃誘導培養(yǎng)5 h，收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測OmpK蛋白表達情況；并利用切膠的方法對OmpK蛋白進行純化。

1.2.3 OmpK小鼠多克隆抗體的制備 選用4～5周齡的雄性昆明鼠5只，每只小鼠每次免疫100 μg純化的OmpK蛋白，對照2只小鼠免疫PBS溶液。首次免疫佐劑采用弗氏完全佐劑，后續(xù)免疫佐劑均采用弗氏不完全佐劑。首次免疫14 d后進行第2次免疫，第2次免疫7 d后進行第3次加強免疫。第3次加強免疫后7 d對小鼠眼部取血，并將血液置于4 ℃冰箱中過夜析出血清，離心后去除沉淀，獲得的上清溶液即為小鼠OmpK抗血清，最后將血清置于-80 ℃冰箱中保存[15]。

1.2.4 OmpK抗體效價與特異性的檢測 利用ELISA法檢測抗血清效價[15]，主要步驟為：將純化的OmpK蛋白定容至5 μg/μL，并將100 μL的OmpK蛋白溶液加入對應的96孔板中，37 ℃ 孵育3 h，加入300 μL封閉液，于37 ℃ 孵育2 h；然后加入100 μL不同稀釋倍數(shù)的小鼠OmpK抗血清(陰性對照選用PBS免疫的小鼠抗血清)，37 ℃孵育40 min；洗滌后加入100 μL HRP標記山羊抗小鼠二抗(1∶3 000倍體積稀釋)，37 ℃孵育40 min；洗滌后加入50 μL底物A(雙氧水)與50 μL底物B(TMB)的混合液，37 ℃避光顯色10 min，最后加入終止液，450 nm讀數(shù)。

采用Western-Blotting方法檢測OmpK小鼠抗血清特異性[16]，主要步驟為：過夜培養(yǎng)溶藻弧菌，樣品處理后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)NC膜，加入小鼠OmpK抗血清(稀釋度體積比分別為1∶400，1∶800，1∶1 600)，對照加入免疫PBS的小鼠抗血清，洗滌后加入HRP標記山羊抗小鼠二抗(1∶3 000倍體積稀釋)，最后DAB顯色，通過顯色條帶的對比確定OmpK抗血清的特異性。

1.2.5 重組蛋白表達條件的優(yōu)化 為確定OmpK蛋白最佳表達條件，選用L9(34)正交試驗模型，對OmpK表達菌株的培養(yǎng)條件與誘導表達條件進行優(yōu)化，正交試驗的因子與水平見表1和表2[17]。

OmpK菌株培養(yǎng)條件正交試驗簡要過程為：取單菌落加入LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)16 h后，以1∶100(體積比)轉(zhuǎn)接菌體至正交試驗要求的新鮮LB培養(yǎng)基中，記錄獲得的菌液OD600值，試驗重復3次。

OmpK菌株誘導表達條件正交試驗簡要過程為：根據(jù)獲得的OmpK菌株最適培養(yǎng)條件，快速培養(yǎng)菌液到表2要求的OD600值，再按照正交試驗模型的要求，加入不同濃度的IPTG誘導相應的時間，吸取1 mL菌液10 000 r/min 離心1 min，沉淀加入300 μL的2×SDS 蛋白上樣緩沖液，煮樣5 min，加樣10 μL進行SDS-PAGE電泳。最后，采用Phoretix 1D軟件對電泳獲得的OmpK蛋白表達圖譜進行光密度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ompK基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建

以溶藻弧菌基因組DNA為模板，進行ompK基因的PCR擴增，獲得816 bp的基因片段，與預期長度一致(圖1-A)。將PCR產(chǎn)物與pET-32a質(zhì)粒雙酶切后，通過T4-DNA連接酶插入pET-32a質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒獲得816 bp片段，與目的基因大小一致(圖1-B)；序列測序結(jié)果證實擴增片段與NCBI公布的基因序列相同，證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.2 OmpK菌株的表達檢測與蛋白純化

為檢測重組蛋白的表達情況，將OmpK表達菌株經(jīng)IPTG誘導后，蛋白電泳獲得約50 ku的蛋白條帶(圖2)，包含OmpK約30 ku，以及pET-32a質(zhì)粒自帶的20.4 ku 融合蛋白標簽，重組蛋白表達情況與預期結(jié)果一致；利用SDS-PAGE電泳切膠的方法純化獲得OmpK蛋白(圖2)。

2.3 OmpK抗體效價與特異性檢測

小鼠經(jīng)過3次免疫后，獲得的OmpK蛋白抗血清經(jīng)ELISA法測定，發(fā)現(xiàn)其抗體效價可以達到1∶1 600(圖3)。利用Western-Blotting顯色技術，發(fā)現(xiàn)不同稀釋度OmpK抗血清出現(xiàn)明顯條帶；而對照陰性抗血清無對應條帶(圖4)。表明OmpK抗血清可與OmpK蛋白特異性結(jié)合，成功制備了OmpK蛋白小鼠抗血清。

2.4 OmpK菌株最適培養(yǎng)條件的正交試驗

表達溶藻弧菌OmpK蛋白的大腸桿菌BL21菌株培養(yǎng)條件的正交試驗結(jié)果見表3，極差分析結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。表4顯示：A1B3C1為OmpK菌株的最佳培養(yǎng)條件，即培養(yǎng)基中不需要加入葡萄糖，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50 mL；方差分析結(jié)果(表5)顯示，葡萄糖含量、轉(zhuǎn)速及裝液量對OmpK表達菌株培養(yǎng)的影響均達到顯著水平。

注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。表8同。

Note:*P<0.05 means the difference with control group is significant.The same for table 8.

2.5 OmpK菌株IPTG誘導條件的正交試驗

溶藻弧菌OmpK蛋白IPTG誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖5。

采用Phoretix 1D軟件分析OmpK蛋白表達量的光密度值，結(jié)果見表6，極差分析結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。表7結(jié)果顯示，最佳OmpK蛋白表達組合為E2F2G2H2，即菌液OD600值為0.8，IPTG終濃度為0.3 mmol/L，誘導時間為8 h，誘導溫度為32 ℃。表8結(jié)果顯示，加IPTG誘導時的菌液濃度對OmpK蛋白表達的影響達到顯著水平。

3 討 論

溶藻弧菌為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)致病菌，長期以來給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失[18]。為控制疫情，人們往往濫用抗生素，從而致使溶藻弧菌耐藥性增強，同時也影響水產(chǎn)品品質(zhì)，對水體造成污染。蛋白亞單位疫苗具有無毒、成本低、無耐藥性等特點[19-20]，受到人們高度重視。OmpK是溶藻弧菌主要外膜蛋白，具有很強的免疫原性[10]，在水產(chǎn)疫苗上有很好的應用前景[13-14]。本研究成功構(gòu)建了溶藻弧菌OmpK表達菌株，獲得純化的OmpK蛋白，免疫小鼠后制備了特異性較好的OmpK抗血清，這為研究OmpK蛋白功能與疫苗開發(fā)奠定了基礎。

本研究通過設計正交試驗模型，成功地對溶藻弧菌OmpK蛋白的表達條件進行了研究：(1)未誘導時，OmpK菌株最佳培養(yǎng)條件為A1B3C1，即不加葡萄糖，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50 mL；(2)IPTG誘導后，OmpK蛋白最佳表達條件為E2F2G2H2，即菌液OD600值0.8，IPTG終濃度0.3 mmol/L，誘導時間8 h，誘導溫度32 ℃。Xu等[21]發(fā)現(xiàn)，提高培養(yǎng)基轉(zhuǎn)速可增加菌體對氧氣與營養(yǎng)的攝取，有利于菌株的生長，這與本試驗結(jié)果一致。IPTG具有毒性[22]，實際生產(chǎn)中應采用低濃度IPTG誘導。此外，合適的誘導時間有利于蛋白的合成[23]，相對于盲目設定誘導時間，節(jié)約了生產(chǎn)成本；因而，在工程菌發(fā)酵上應采用合適的誘導時間。此外，低溫誘導利于蛋白表達[23-24]，與本研究結(jié)果一致。因而，OmpK工程菌蛋白發(fā)酵可按2步法進行：(1)IPTG誘導前，提高培養(yǎng)基轉(zhuǎn)速使菌體快速生長到誘導濃度；(2)IPTG誘導后，可在菌株對數(shù)生長中期加入低濃度IPTG誘導，低溫且誘導時間不易過長。

[1] 李明云,丁文超,陳 炯.溶藻弧菌外膜蛋白OmpK基因表達和間接ELISA檢測方法的初步建立 [J].水產(chǎn)學報,2010,34(10):1559-1565.

Li M Y,Ding W C,Chen J.Expression of OmpK gene ofVibrioalginolyticusand development of a detection method of indect ELISA [J].Journal of Fishery Sciences of China,2010,34(10):1559-1565.(in Chinese)

[2] Wei S,Zhao H,Xian Y,et al.Multiplex PCR assays for the detection ofVibrioalginolyticus,Vibrioparahaemolyticus,Vibriovulnificus,andVibriocholeraewith an internal amplification control [J].Diagn Microbiol Infect Dis,2014,79(2):115-118.

[3] 熊 盼,彭喜春,魏 霜,等.溶藻弧菌的毒力相關基因及其對小鼠的致病力 [J].微生物學報,2014,54(1):80-88.

Xiong P,Peng X C,Wei S,et al.Virulence-related genes ofVibrioalginolyticusand its virulence in mice [J].Acta Microbiologica Sinica,2014,54(1):80-88.(in Chinese)

[4] 張崇文,毛芝娟,于 漣.大黃魚三種病原弧菌外膜蛋白交叉保護性抗原篩選 [J].生物工程學報,2012,28(12):1460-1472.

Zhang C W,Mao Z J,Yu L.Selection of cross-protective antigens from outer membrane proteins of three pathogenic vibrios isolated from infected large yellow croaker (Pseudosciaenacrocea) [J].Chinese Journal of Biotechnology,2012,28(12):1460-1472.(in Chinese)

[5] 陳春琳,俱 雄,萬 健,等.革蘭陰性菌外膜蛋白 A 研究進展 [J].生物技術,2014,24(2):98-103.

Chen C L,Ju X,Wan J,et al.Progress of study on outer membrane protein A of gram negative bacteria [J].Biotechnology,2014,24(2):98-103.(in Chinese)

[6] Li C,Ye Z,Wen L,et al.Identification of a novel vaccine candidate by immunogenic screening ofVibrioparahaemolyticusouter membrane proteins [J].Vaccine,2014,32(46):6115-6121.

[7] 倫鏡盛,袁傳飛,夏常艷,等.弧菌外膜蛋白 OmpK 免疫交叉反應性的分析 [J].汕頭大學學報,2013,28(3):52-63.

Lun J S，Yuan C F,Xia C Y,et al.Immunological cross-reactivity analysis among outer membrane protein K ofVibriospecies [J].Journal of Shantou University,2013,28(3):52-63.(in Chinese)

[8] Li N Q,Bai J J,Wu S Q,et al.An outer membrane protein,OmpK,is an effective vaccine candidate forVibrioharveyiin orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides) [J].Fish Shellfish Immunol,2008,25(6):829-833.

[9] Mao Z J,He C J,Qiu Y Y,et al.Expression ofVibrioharveyiompK in the yeastPichiapastoris：The first step in developing an oral vaccine against vibriosis [J].Aquaculture,2011,318:268-272.

[10] Hamod M A,Nithin M S,Shukur Y N,et al.Outer membrane protein K as a subunit vaccine againstV.anguillarum[J].Aquaculture,2012(354/355):107-110.

[11] 李梅芳,毛芝娟,韓雨杉,等.殼聚糖-海藻酸鈉包被的副溶血弧菌外膜蛋白 K微球疫苗的制備及其口服免疫效果 [J].中國生物制品學雜志,2014,27(5):601-606.

Li M F,Mao Z J,Han Y S,et al.Preparation of chitosan-alginate encapsulated microspheres of outer membrane protein K ofVibrioparahaemolyticusand efficiency of oral vaccination [J].Chin J Biologicals,2014,27(5):601-606.(in Chinese)

[12] 鄭 磊,郭養(yǎng)浩,馬振寧,等.副溶血弧菌融合蛋白FlaA-OmpK 疫苗的制備及免疫保護作用 [J].中國水產(chǎn)科學,2012,19(5):848-853.

Zheng L,Guo Y H,Ma Z N,et al.Expression and immune characteristics of FlaA-OmpK protein inVibrioparahaemolyticus[J].Journal of Fishery Sciences of China,2012,19(5):848-853.(in Chinese)

[13] Li Y D,Ren H L,Lu S Y,et al.Cloning,expression,and genus-specificity analysis of 28-kDa OmpK fromVibrioalginolyticus[J].J Food Sci,2010,75(4):198-203.

[14] Li N,Yang Z,Bai J,et al.A shared antigen amongVibriospecies:Outer membrane protein-OmpK as a versatileVibriosisvaccine candidate in orange-spotted grouper (Epinepheluscoioides) [J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(5/6):952-956.

[15] 劉 祥,陳春琳,牟 歡,等.重組人骨硬化蛋白的表達、純化及多克隆抗體制備 [J].生物技術,2014,24(6):68-72.

Liu X,Chen C L,Mou H,et al.Expression，purification and polyclonal antibody preparation of human sclerostin [J].Biotechnology,2014,24(6):68-72.(in Chinese)

[16] 劉 祥.福氏志賀菌2型外膜蛋白A的原核表達及多克隆抗體的制備 [J].動物醫(yī)學進展,2015,36(5):6-10.

Liu X.Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation ofShigellaflexneri2A outer membrane protein A [J].Progress in Veterinary Medicine,2015,36(5):6-10.(in Chinese)

[17] 劉 祥.銅綠假單胞菌外膜蛋白F原核載體構(gòu)建、表達條件優(yōu)化及免疫保護作用研究 [J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2015,25(11):12-16.

Liu X.Construction of prokaryotic vector and optimization of expression conditions of outer membrane protein F ofPseudomonasaeruginosaand its immunoprotection potential [J].China Journal of Modern Medicine,2015,25(11):12-16.(in Chinese)

[18] Wang Y D,Peng K C,Wu J L,et al.Transgenic expression of salmon delta-5 and delta-6 desaturase in zebrafish muscle inhibits the growth ofVibrioalginolyticusand affects fish immunomodulatory activity [J].Fish Shellfish Immunol,2014,39(2):223-230.

[19] Lazo L,Izquierdo A,Suzarte E,et al.Evaluation in mice of the immunogenicity and protective efficacy of a tetravalent subunit vaccine candidate against dengue virus [J].Microbiol Immunol,2014,58(4):219-226.

[20] Mire C E,Geisbert J B,Agans K N,et al.A recombinantHendravirusglycoprotein subunit vaccine protects nonhuman primates againstHendraviruschallenge [J].J Virol,2014,88(9):4624-4631.

[21] Xu M,Sun Q,Su J,et al.Microbial transformation of geniposide inGardeniajasminoidesEllis into genipin byPenicilliumnigricans[J].Enzyme Microb Tech,2008,42(5):440-444.

[22] Corrales-Garcia L,Ortiz E,Castaeda-Delgado J,et al.Bacterial expression and antibiotic activities of recombinant variants of human β-defensins on pathogenic bacteria andM.tuberculosis[J].Protein Expr Purif,2013,89(1):33-43.

[23] 劉 祥.溶藻弧菌附著定植因子ACFA原核載體構(gòu)建、表達條件優(yōu)化及多克隆抗體制備 [J].華北農(nóng)學報,2015,30(1):35-41.

Liu X.Construction prokaryotic vector,optimization expression conditions and polyclonal antibody preparation ofVibrioalginolyticusaccessory colonization factor ACFA [J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2015,30(1):35-41.(in Chinese)

[24] Studier F W.Protein production by auto-induction in high den-sity shaking cultures [J].Protein Expr Purif,2005,41(1):207-234.

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of outer membrane protein OmpK inVibrioalginolyticus

CHEN Chun-lin,LIU Xiang,JU Xiong

(CollegeofBiologicalSciencesandEngineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong,Shaanxi723001,China)

【Objective】 This study aimed to construct prokaryotic expression vector ofVibrioalginolyticusouter membrane protein K (OmpK),optimize the expression condition of OmpK,and prepare the polyclonal antibodies of mouse anti-OmpK.【Method】ompKgene was obtained by PCR amplification before being connected to pET-32a plasmid for OmpK-pET32a vector.Then,the vector was transformed toE.coliBL21 for OmpK protein expression strain.OmpK was purified by the gel slicing method,and the polyclonal antibody was prepared using immunized mice.The antibody titer and specificity were detected by ELISA and Western-Blotting,respectively.The optimal inducing and culturing conditions were also gained by orthogonal experiment.【Result】 PCR amplification obtained 816 bpompKgene.OmpK-pET32a vector was constructed successfully,and the induced expression product was 30 ku.The OmpK antibody titer was 1∶1 600 obtained by ELISA,and Western-Blotting proved that the antiserum had good specificity.The optimal inducing conditions for OmpK protein expression were:strain OD600value,IPTG final concentration,inducing time and temperature were 0.8,0.3 mmol/L,8 h,and 32 ℃,respectively while the optimal culturing conditions were:rotation rate,glucose concentration,and medium volume were 230 r/min,0 glucose and 50 mL,respectively.【Conclusion】 The OmpK polyclonal antibodies were successfully prepared and the optimal inducing and culturing conditions were obtained.

Vibrioalginolyticus;OmpK protein;prokaryotic expression;polyclonal antibody

2014-06-26

陜西省教育廳科學研究計劃項目(2013JK0723)；陜西理工學院人才啟動項目(SLGQD13-15)

陳春琳(1982-)，女，安徽合肥人，碩士，主要從事分子生物學研究。E-mail:chchl888@163.com

劉 祥(1983-)，男，安徽合肥人，講師，博士，主要從事蛋白質(zhì)組學與免疫學研究。E-mail:liuxiang888525@163.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.022

Q78

A

1671-9387(2015)07-0007-08

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.022.html