周 琳，張 琪，梁 帥，余關(guān)林，趙善廷，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

NDV、KLT及其聯(lián)用時(shí)小鼠H22肝癌瘤組織的病理變化與TNF-α表達(dá)的研究

周 琳，張 琪，梁 帥，余關(guān)林，趙善廷，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 研究新城疫病毒(New Castle Disease Virus，NDV)、康萊特注射液 (Kanglaite Injection，KLT)及NDV+KLT聯(lián)用治療肝癌腫瘤過(guò)程中，癌組織的病理變化以及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)在腫瘤組織中的表達(dá)情況，探究TNF-α在抗腫瘤過(guò)程中的作用，為應(yīng)用生物素治療腫瘤提供一定的理論依據(jù)?！痉椒ā?建立小鼠H22肝癌腫瘤模型，將96只荷瘤小鼠隨機(jī)均分成生理鹽水對(duì)照組(0.8 mL/只)、NDV治療組(0.8 mL/只)、KLT治療組(0.5 mL/只)及NDV+KLT聯(lián)合治療組共4組，分別在治療后的4，8，12和16 d取小鼠腫瘤組織制作2套石蠟切片，一套進(jìn)行HE染色檢測(cè)病理變化；另一套進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP觀察TNF-α的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】 HE染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比， NDV組和KLT組都有明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制及腫瘤細(xì)胞壞死現(xiàn)象，特別是NDV+KLT聯(lián)合治療組的治療效果顯著；免疫組化研究結(jié)果表明，不同的治療組TNF-α分布差異顯著，其中NDV+KLT聯(lián)合治療組的陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)，其次是KLT治療組?！窘Y(jié)論】 NDV和KLT的抗腫瘤作用與TNF-α細(xì)胞因子表達(dá)有一定的相關(guān)性，其中NDV+KLT聯(lián)合治療的抗腫瘤效果最好。

TNF-α；NDV；KLT；H22肝癌

20世紀(jì)50年代，人們發(fā)現(xiàn)新城疫病毒(New Castle Disease Virus,NDV)具有抑制晚期胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，且只特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)人正常成纖維細(xì)胞沒(méi)有影響[1]。此后，NDV作為新型的抗腫瘤制劑被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛研究，國(guó)外已將新城疫病毒應(yīng)用于臨床生物治療[2]。NDV的抗腫瘤效應(yīng)是多方面的，其能直接殺傷腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能及誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如干擾素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、單核細(xì)胞集落刺激因子等[3]?？等R特注射液(Kanglaite Injection,KLT)是以從薏苡仁中提取的天然有效抗癌活性物質(zhì)——薏苡仁油為原料，通過(guò)先進(jìn)制劑工藝研制而成的可供靜、動(dòng)脈直接大劑量輸注的新型脂肪乳劑[4]。研究證實(shí)，KLT對(duì)體內(nèi)外多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷和抑制效果，且無(wú)明顯不良反應(yīng)，已用于多種惡性腫瘤的臨床治療，是一種臨床運(yùn)用效果較好的抗腫瘤藥物[5-6]。

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強(qiáng)的生物因子[7-8]，具有明顯的細(xì)胞毒作用，對(duì)腫瘤有抑制作用。TNF-α的抗腫瘤機(jī)制很復(fù)雜，TNF-α可以通過(guò)與靶細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子受體(TNFR)結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞毒性、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[9]；還可通過(guò)引發(fā)細(xì)胞免疫與體液免疫，增強(qiáng)宿主免疫功能[10]，進(jìn)而阻斷腫瘤血管的生成[11]，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。TNF-α還可提高抗腫瘤藥物的療效[12-14]，臨床上聯(lián)合使用TNF-α可以明顯增強(qiáng)化療藥物的療效，卻不增加毒性，但機(jī)制還不甚明確。本試驗(yàn)構(gòu)建了小鼠肝癌腫瘤模型，用NDV、KLT和NDV+KLT治療荷瘤小鼠，運(yùn)用HE染色和免疫組化方法，觀察腫瘤組織的病理變化及TNF-α的分布差異情況，以期從形態(tài)學(xué)上闡明NDV和KLT聯(lián)合治療腫瘤的效果，以期為利用二者治療腫瘤提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和瘤株 昆明種雌性小白鼠96只(體質(zhì)量18～22 g/只)和H22肝癌瘤源，均購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 病毒、藥品及主要試劑 NDV弱毒，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室提供，血凝價(jià)(HA)29；康萊特注射液，購(gòu)自浙江省康萊特藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：1107161-2)；TNF-α抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司(產(chǎn)品貨號(hào)：BAO131)；APES、抗原修復(fù)液，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；免疫組化試劑盒，購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 腫瘤模型的建立 將瘤細(xì)胞H22用Hank’s液稀釋至4×107個(gè)/mL，小白鼠左前肢腋下注射瘤細(xì)胞懸液，皮下注射，注射劑量為0.1 mL/只。

1.2.2 試驗(yàn)分組及用藥 自建立腫瘤模型當(dāng)日起，將96只荷瘤小鼠隨機(jī)平均分成4組，Ⅰ組：陰性對(duì)照組，皮下注射生理鹽水0.8 mL/只；Ⅱ組：NDV治療組，皮下注射N(xiāo)DV弱毒0.8 mL/只；Ⅲ組：KLT注射液治療組，腹腔注射KLT注射液0.5 mL/只；Ⅳ組：NDV+KLT注射液聯(lián)用組，皮下注射N(xiāo)DV弱毒0.8 mL/只，腹腔注射KLT注射液0.5 mL/只。KLT注射液每日注射，NDV弱毒和生理鹽水均隔日注射。

1.2.3 HE染色及免疫組化 分別在4，8，12和16 d，每組各取6只攜瘤小鼠，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛0.1 mL/只麻醉。心臟灌注后，取小鼠的腫瘤組織，置于體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定24 h以上，組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，做連續(xù)切片(片厚5 μm)。試驗(yàn)共制作2套切片，一套切片做HE染色，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境動(dòng)態(tài)變化；另一套按免疫組化試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)TNF-α分布差異情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 腫瘤組織的病理組織學(xué)變化

2.1.1 4 d病理組織學(xué)變化 4 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛，腫瘤細(xì)胞數(shù)量很多，胞核胞質(zhì)染色很深，核質(zhì)比較高，嗜堿性強(qiáng)，異型性高，伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1-A)。Ⅱ組腫瘤組織生長(zhǎng)不旺盛，胞核嗜堿性強(qiáng)，胞質(zhì)弱嗜酸性，部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生核固縮、核裂解，出現(xiàn)變性壞死區(qū)，有較多數(shù)的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1-B)。Ⅲ組腫瘤組織總體生長(zhǎng)較慢，但靠近肌肉組織部位生長(zhǎng)相對(duì)旺盛，腫瘤細(xì)胞嗜堿性強(qiáng)，大面積的變性壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸性較強(qiáng)，并有較大量的淋巴細(xì)胞和其他的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1-C)。Ⅳ組腫瘤組織生長(zhǎng)緩慢，腫瘤細(xì)胞異型性下降，出現(xiàn)大面積壞死區(qū)和空泡變性區(qū)，壞死區(qū)大部分腫瘤細(xì)胞核裂解并溶解，有炎性細(xì)胞帶(圖1-D)。

2.1.2 8 d病理組織學(xué)變化 8 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛，腫瘤細(xì)胞數(shù)量多，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，侵入到肌肉組織，異型性很高，胞核胞質(zhì)著色很深，嗜堿性很強(qiáng)(圖2-A)。Ⅱ組腫瘤組織生長(zhǎng)較為旺盛，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)到肌肉組織，出現(xiàn)變性壞死區(qū)，其腫瘤細(xì)胞核固縮、核裂解，且嗜酸性增強(qiáng)，未發(fā)生變性壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，也可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死(圖2-B)。Ⅲ組腫瘤組織生長(zhǎng)較旺盛，出現(xiàn)較大面積的變性壞死區(qū)和空泡，腫瘤細(xì)胞溶解，未發(fā)生壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，嗜酸性增強(qiáng)，壞死區(qū)可見(jiàn)較大量的淋巴細(xì)胞和其他的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2-C)。Ⅳ組腫瘤組織出現(xiàn)大面積壞死區(qū)和大量空泡，壞死區(qū)大部分腫瘤細(xì)胞溶解，未發(fā)生壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)仍相對(duì)旺盛，有大量巨噬細(xì)胞及其他的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2-D)。

2.1.3 12 d病理組織學(xué)變化 12 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，在腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛部位腫瘤細(xì)胞異型性很高，出現(xiàn)變性壞死，可見(jiàn)少量的空泡(圖3-A)。Ⅱ組腫瘤組織生長(zhǎng)不旺盛，出現(xiàn)大面積變性壞死區(qū)和空泡，腫瘤細(xì)胞異型性下降，胞質(zhì)胞核嗜酸性增強(qiáng)，在壞死區(qū)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3-B)。Ⅲ組腫瘤組織生長(zhǎng)不旺盛，出現(xiàn)大面積變性壞死和空泡區(qū)，多數(shù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死溶解，胞核胞質(zhì)呈弱嗜酸性，有明顯的核固縮、核裂解現(xiàn)象(圖3-C)。Ⅳ組腫瘤組織整體嗜酸性增強(qiáng)，出現(xiàn)大面積壞死區(qū)，腫瘤細(xì)胞大部分壞死溶解，腫瘤細(xì)胞嗜酸性較強(qiáng)(圖3-D)。

2.1.4 16 d病理組織學(xué)變化 16 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛，胞核胞質(zhì)嗜堿性較強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞異型性降低，可見(jiàn)空泡變性，部分細(xì)胞死亡，出現(xiàn)壞死區(qū)域(圖4-A)。Ⅱ組腫瘤組織生長(zhǎng)緩慢，大量腫瘤細(xì)胞核固縮、核溶解，且嗜酸性增強(qiáng)，有大面積壞死區(qū)(圖4-B)。Ⅲ組腫瘤組織生長(zhǎng)不旺盛，腫瘤細(xì)胞大面積壞死，胞核空泡變性或裂解，大量腫瘤細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng)，壞死區(qū)的腫瘤細(xì)胞多數(shù)溶解(圖4-C)。Ⅳ組腫瘤組織幾乎不生長(zhǎng)，大量瘤細(xì)胞溶解，細(xì)胞較小，嗜酸性很強(qiáng)，呈現(xiàn)大量空泡變性，壞死區(qū)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞也大量的溶解(圖4-D)。

2.2 TNF-α在腫瘤組織中的表達(dá)情況

免疫組化SP法染色的切片，背景無(wú)色，若免疫陽(yáng)性產(chǎn)物為淺棕色或者淺黃色，對(duì)照組切片染色為陰性，則說(shuō)明試驗(yàn)具有免疫反應(yīng)的特異性。根據(jù)染色的深淺可分為弱陽(yáng)性(著色淺，+)、陽(yáng)性(中等著色，++)、強(qiáng)陽(yáng)性(著色深，+++)三級(jí)。本試驗(yàn)對(duì)照組染色均為陰性，說(shuō)明免疫組化SP法具有 TNF-α 免疫反應(yīng)的特異性。

2.2.1 4 d時(shí)TNF-α的表達(dá)情況 4 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織不著色或者著色很淺，呈現(xiàn)微弱的弱陽(yáng)性，僅有少數(shù)細(xì)胞膜呈弱陽(yáng)性(+)(圖5-A)。Ⅱ 組腫瘤組織壞死區(qū)域呈陽(yáng)性(++)，空泡邊緣及壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)較強(qiáng)，壞死區(qū)細(xì)胞基質(zhì)中可見(jiàn)豐富的被淡染的膠原纖維，腫瘤組織生長(zhǎng)旺盛區(qū)腫瘤細(xì)胞膜呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)性，胞質(zhì)呈微弱的弱陽(yáng)性(圖5-B)。Ⅲ組腫瘤組織中等著色，呈現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)(++)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，胞質(zhì)呈陽(yáng)性反應(yīng)，巨噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞也表現(xiàn)為較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)?；|(zhì)中的膠原纖維豐富(圖5-C)。Ⅳ 組腫瘤組織著色較深，呈現(xiàn)為陽(yáng)性(++)，炎性細(xì)胞數(shù)很多，胞膜、胞質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(+++)；空泡邊緣及周?chē)[瘤細(xì)胞都呈陽(yáng)性反應(yīng)，基質(zhì)中豐富的膠原纖維和血管也呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖5-D)。

2.2.2 8 d時(shí)TNF-α的表達(dá)情況 8 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織不著色或著色較淺，僅空泡邊緣的細(xì)胞膜可見(jiàn)微弱的著色，呈現(xiàn)為微弱的弱陽(yáng)性(+)(圖6-A)。Ⅱ組腫瘤組織整體著色微淺棕黃色，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)都呈弱陽(yáng)性反應(yīng)(+)，少數(shù)腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)(++)，空泡邊緣及血管組織呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖6-B)。Ⅲ組腫瘤組織著色較淺，呈現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)(++)，腫瘤細(xì)胞多數(shù)為陽(yáng)性，胞膜著色相對(duì)較深，在空泡變性區(qū)邊緣著色相對(duì)較深，炎性細(xì)胞也表現(xiàn)為較強(qiáng)的陽(yáng)性，壞死區(qū)可見(jiàn)染色較淺的膠原纖維(圖6-C)。Ⅳ組腫瘤組織著色較其他組深，呈現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(+++)，空泡區(qū)邊緣著色較深，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛區(qū)僅見(jiàn)胞膜呈陽(yáng)性，胞質(zhì)為弱陽(yáng)性(圖6-D)。

2.2.3 12 d時(shí)TNF-α的表達(dá)情況 12 d時(shí)，Ⅰ組腫瘤組織著色較淺，呈現(xiàn)弱陽(yáng)性反應(yīng)(+)，少數(shù)腫瘤細(xì)胞膜呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，腫瘤組織邊緣壞死區(qū)基質(zhì)中可見(jiàn)淡染為淺黃色的膠原纖維(圖7-A)。Ⅱ組腫瘤組織著色較深，腫瘤細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)均呈較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(++)，空泡區(qū)邊緣及周?chē)[瘤細(xì)胞陽(yáng)性，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)陽(yáng)性較壞死溶解區(qū)陽(yáng)性強(qiáng)(圖7-B)。Ⅲ組腫瘤組織整體呈現(xiàn)較強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(++)，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)可見(jiàn)胞膜胞質(zhì)呈較強(qiáng)陽(yáng)性，還可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞間連接有豐富的膠原纖維，血管組織染色較深，呈陽(yáng)性反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)呈弱陽(yáng)性(+)(圖7-C)。Ⅳ組腫瘤組織呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(+++)，腫瘤細(xì)胞溶解壞死區(qū)著色很深，腫瘤細(xì)胞的胞膜胞質(zhì)均呈強(qiáng)陽(yáng)性，有大量呈強(qiáng)陽(yáng)性的炎性細(xì)胞，這些細(xì)胞中間分布著許多著色很淺的膠原纖維(圖7-D)。

2.2.4 16 d時(shí)TNF-α的表達(dá)情況 16 d時(shí)，Ⅰ腫瘤組織著色淺，呈現(xiàn)弱陽(yáng)性反應(yīng)(+)，少數(shù)腫瘤細(xì)胞膜呈陽(yáng)性反應(yīng)，壞死區(qū)較生長(zhǎng)區(qū)著色稍深(圖8-A)。Ⅱ組腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)(++)，腫瘤細(xì)胞胞膜呈陽(yáng)性反應(yīng)，胞質(zhì)弱陽(yáng)性，壞死溶解區(qū)有許多膠原纖維呈陽(yáng)性(圖8-B)。Ⅲ組腫瘤組織整體呈現(xiàn)較強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(++)，腫瘤細(xì)胞胞膜胞質(zhì)著色深，呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(+++)，壞死區(qū)腫瘤細(xì)胞著色相對(duì)較淺，呈陽(yáng)性反應(yīng)，基質(zhì)中血管組織及周?chē)?xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)(圖8-C)。Ⅳ組腫瘤組織著色淺，呈現(xiàn)弱陽(yáng)性反應(yīng)(+)，腫瘤細(xì)胞膜可見(jiàn)微弱的陽(yáng)性，壞死溶解的腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞都幾乎不著色(圖8-D)。

3 討 論

NDV、KLT注射液均有抗腫瘤的作用，有研究已經(jīng)證實(shí)NDV+KLT聯(lián)合作用抗腫瘤效果更強(qiáng)[15]。NDV抗腫瘤作用機(jī)制尚不完全清楚，迄今為止的研究表明，NDV感染機(jī)體后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生如干擾素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、單核細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子[3]，大量文獻(xiàn)表明NDV能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生TNF-α，其可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡、作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，在破壞腫瘤組織血管、增加抗腫瘤藥物療效、降低對(duì)腫瘤細(xì)胞的耐藥性、介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用[8]。KLT注射液在我國(guó)中醫(yī)臨床治療腫瘤中被廣泛應(yīng)用，其主要抗癌活性成分是薏苡仁中的薏苡仁甘油酯，近幾十年的臨床試驗(yàn)表明，康萊特注射液對(duì)提高治療效果、改善病人的生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期及降低化療藥物的不良反應(yīng)、調(diào)整機(jī)體狀況、提高機(jī)體的免疫功能具有非常重要的意義[16]。其發(fā)揮作用的藥理基礎(chǔ)是能夠阻滯G2+M期時(shí)相細(xì)胞，并導(dǎo)致細(xì)胞百分比下降，減少有絲分裂，致使DNA合成減少，腫瘤細(xì)胞增殖受抑，并激活促細(xì)胞凋亡因子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而起到抑制腫瘤發(fā)展的作用[17]。KLT不僅具有抗腫瘤作用，還能夠提高機(jī)體免疫力，這是其抗腫瘤的一大優(yōu)勢(shì)。

本試驗(yàn)從病理組織學(xué)角度觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)旺盛，浸潤(rùn)到肌肉組織，治療組相對(duì)生長(zhǎng)緩慢，到12和16 d表現(xiàn)為不生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞大量壞死。NDV組8，12和16 d腫瘤細(xì)胞的異型性降低，嗜酸性增強(qiáng)，出現(xiàn)核固縮、核裂解現(xiàn)象，空泡區(qū)和壞死面積比對(duì)照組大得多，8和12 d時(shí)炎性細(xì)胞數(shù)量也較多，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性逐漸增強(qiáng)。KLT組在12和16 d時(shí)，腫瘤細(xì)胞大量壞死溶解，可見(jiàn)大面積壞死區(qū)，與NDV組同一時(shí)間相比，KLT組腫瘤組織壞死稍加明顯。NDV+KLT組在4，8，12和16 d均表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞大量壞死，壞死部位細(xì)胞嗜酸性明顯增強(qiáng)，壞死區(qū)域面積很大，在8和12 d時(shí)可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，16 d時(shí)表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞和炎性細(xì)胞的大量壞死，腫瘤組織嗜酸性很強(qiáng)。由此表明，NDV和KLT都具有較好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，且兩者聯(lián)合使用治療效果更好。免疫組化SP法觀察TNF-α的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，各組均有表達(dá)，在4，8和12 d時(shí)TNF-α在壞死區(qū)陽(yáng)性反應(yīng)比生長(zhǎng)旺盛區(qū)腫瘤組織強(qiáng)，NDV+KLT組在4和12 d時(shí)出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，腫瘤生長(zhǎng)旺盛區(qū)表達(dá)很弱，在16 d時(shí)可見(jiàn)大量壞死區(qū)表現(xiàn)為弱陽(yáng)性甚至陰性。NDV+KLT 組相比于其他治療組，陽(yáng)性反應(yīng)更加明顯，其次就是KLT治療組，此結(jié)果反映的情況與HE染色結(jié)果相一致。由此分析，NDV和KLT 能夠刺激機(jī)體中TNF-α產(chǎn)生，并發(fā)揮抗腫瘤作用，引起腫瘤細(xì)胞變性壞死，而作用后期，TNF-α的表達(dá)量又下降，據(jù)此可推測(cè)，TNF-α參與了腫瘤組織的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和凋亡過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞的凋亡存在一定的關(guān)系。這也進(jìn)一步證明了NDV的抗腫瘤作用機(jī)制之一是與細(xì)胞因子密切相關(guān)。前人的研究已證實(shí)，TNF-α可以作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管功能的紊亂[8]，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞在不同的作用時(shí)間和不同藥物治療下，TNF-α的表達(dá)情況具有明顯差異，說(shuō)明腫瘤的生長(zhǎng)與血管的生成有很大關(guān)聯(lián)。免疫組化試驗(yàn)各組中膠原纖維的陽(yáng)性表達(dá)情況也很不相同，膠原纖維是由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的，成纖維細(xì)胞在機(jī)體損傷修復(fù)時(shí)會(huì)明顯增多，形成膠原纖維，這提示膠原纖維的形成與腫瘤組織生長(zhǎng)或壞死有一定的相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，KLT和NDV抗腫瘤作用與細(xì)胞因子的分泌有密切關(guān)系，這將為人類(lèi)利用生物因素治療腫瘤提供一定的理論依據(jù)，但其深層作用機(jī)制很復(fù)雜，還有待進(jìn)一步深入探究。

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Effects of NDV,KLT and their combination on pathological changes of tumor tissue and expression of TNF-α of mice with H22liver cancer

ZHOU Lin,ZHANG Qi,LIANG Shuai,YU Guan-lin,ZHAO Shan-ting,XU Xin-gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study used New Castle Disease Virus (NDV),Kanglaite Injection (KLT) and their combination to treat liver cancer.The pathological changes of tumor tissue and expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) were analyzed to understand the function of TNF-α in cancer treatment.【Method】 Mice H22tumor model was established with 96 tumor-bearing mice randomly divided into four groups,NS control group (0.8 mL),NDV treatment group (0.8 mL),KLT treatment group (0.5 mL) and NDV+KLT treatment group.Tumor tissue was obtained from every group in the 4,8,12 and 16 d respectively.Paraffin sections were made to observe pathological changes using hematoxylin-eosin (HE) staining and expression of TNF-α using immunohistochemistry SP method.【Result】 HE staining showed that,compared with NS control group,tumor growth inhibition and tumor cells necrosis appeared,especially NDV+KLT treatment group had significant treatment effect.Compared with NS control group,pathological changes of tumor tissue and distribution of TNF-α were significantly different in all treatment groups,especially in NDV+KLT group.NDV+KLT group also had the strongest positive reaction,followed by KLT treatment group.【Conclusion】 Anti-tumor effect of NDV and KLT was related to expression of TNF-α and combination of NDV and KLT had the best effect.

TNF-α;NDV;KLT;H22liver cancer

2014-01-10

西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(Z109021427)；西北農(nóng)林科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(Z109021116)

周 琳(1987-)，女，河南濟(jì)源人，在讀碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：zhouyan15191901947@163.com

許信剛(1974-)，男，陜西咸陽(yáng)人，副教授，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：286567031@qq.com

時(shí)間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.026

S852.3

A

1671-9387(2015)07-0015-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.026.html