王 征，伍江波，劉雪梅，金曉玲

(中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長沙 410004)

杜仲愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系的建立

王 征，伍江波，劉雪梅，金曉玲

(中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長沙 410004)

【目的】 研究在BA、NAA、IBA、2,4-D等激素作用下，杜仲愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽及叢生芽誘導(dǎo)生根各階段的最佳培養(yǎng)基配方，建立杜仲植株再生體系，為杜仲轉(zhuǎn)基因研究提供基礎(chǔ)材料?！痉椒ā?以杜仲成熟胚、幼嫩胚、葉片和莖段為外植體，使用BA、NAA、IBA、2,4-D等激素，配制成不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基，進行杜仲愈傷組織誘導(dǎo)，同時分析愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽和叢生芽誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的最佳配方，建立杜仲植株的再生體系。【結(jié)果】 杜仲愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基分別為：成熟胚MS+BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L， 誘導(dǎo)率77.8%；幼嫩胚MS+BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L， 誘導(dǎo)率88.9%；葉片MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L， 誘導(dǎo)率100%；莖段MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率為100%。愈傷組織誘導(dǎo)不定芽形成的適宜培養(yǎng)基為MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，不定芽誘導(dǎo)率為88.9%，增殖系數(shù)為3±1；杜仲在1/4MS的基本培養(yǎng)基中生根最好，生根率達(dá)80%，激素的存在反而會抑制生根?！窘Y(jié)論】 杜仲成熟胚、幼嫩胚、葉片和莖段均可通過愈傷組織途徑誘導(dǎo)不定芽的形成，并誘導(dǎo)生根，建立杜仲愈傷組織再生體系，但不定芽的增殖系數(shù)較低。

杜仲；成熟胚；繼代周期；不定芽；愈傷組織

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)為杜仲科杜仲屬，是第三紀(jì)孑遺植物[1],為國家二級保護植物[2]。杜仲是傳統(tǒng)的名貴中藥，其所含的綠原酸、桃葉珊瑚苷和黃酮類物質(zhì)具有調(diào)節(jié)血壓、降血糖和增強免疫力等功能[3-5]。另外，杜仲組織器官內(nèi)所含的杜仲膠具有獨特的“橡膠-塑料二重性”，這大大地拓展了杜仲的應(yīng)用領(lǐng)域[6]。目前，國內(nèi)外相關(guān)的研究主要集中在杜仲的栽培、繁殖、化學(xué)成分及遺傳學(xué)等方面[7-11]。杜仲不同品種間的有效成分和杜仲膠含量差異很大[12]。于20世紀(jì)90年代起，國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心等單位率先選育出了“華仲01”～“華仲05”等5個杜仲優(yōu)良無性系，填補了我國杜仲良種的空白[13]。目前，有關(guān)杜仲主要有效成分綠原酸和杜仲膠的合成途徑已經(jīng)闡明，其中的關(guān)鍵酶也被發(fā)現(xiàn)，使得利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高產(chǎn)杜仲新品種的設(shè)想成為可能[14]。雖然杜仲的組織培養(yǎng)在實驗室層面已經(jīng)獲得成功，但是仍然有許多的問題，如初代誘導(dǎo)出芽率低，易污染，叢生芽增殖系數(shù)低等，這些都嚴(yán)重影響著杜仲組織培養(yǎng)的發(fā)展，并制約了杜仲組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)技術(shù)的推廣和應(yīng)用。為此，本研究以杜仲多種組織為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，在MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度組合的NAA、BA、IBA、2,4-D等激素，分析愈傷組織誘導(dǎo)效果，獲得愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)及生根誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方，建立了完整的杜仲植株再生體系，以期為杜仲轉(zhuǎn)基因研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為國家林業(yè)局經(jīng)濟林研究所培育的“華仲05”優(yōu)良植株。所用的外植體類型有：成熟胚、幼嫩胚、莖段和葉片，愈傷組織及不定芽。

1.2 方 法

1.2.1 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織條件的確定 在愈傷組織誘導(dǎo)階段，試驗中所使用的外植體類型有成熟胚、幼嫩胚、莖段、葉片。外植體經(jīng)酒精消毒后再使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞溶液振蕩消毒1 min，并切成0.5 cm的長段備用。

(1)在以成熟胚和葉片為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)時，均以MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA和細(xì)胞分裂素BA，構(gòu)成14個組合(表1)。

(2)在以幼嫩胚為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)時，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA、2,4-D和細(xì)胞分裂素BA，構(gòu)成10個組合(表2)。

(3)在以莖段為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)時，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA和細(xì)胞分裂素BA，構(gòu)成9個組合(表3)。

將上述不同外植體接種在不同組合的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。以判斷杜仲不同外植體類型誘導(dǎo)愈傷組織的最佳條件。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)不定芽條件的確定 試驗中的外植體為黃綠色愈傷組織，從無菌培養(yǎng)基中取出，因此無需消毒處理，直接將其切成0.5 cm×0.5 cm的塊狀備用?；九囵B(yǎng)基為MS，培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA和細(xì)胞分裂素BA，共構(gòu)成10個組合(表4)。將外植體接種于不同組合的MS培養(yǎng)基上， 30 d后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率，計算增殖系數(shù)。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)生根條件的確定 試驗中使用的外植體為長3～4 cm的不定芽。在研究植物激素劑量配比對杜仲不定芽生根情況的影響時，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素IBA和生長素NAA，共構(gòu)成6個組合(表5)。另外，分別以培養(yǎng)基MS、1/2MS、1/4MS為基本培養(yǎng)基，附加細(xì)胞分裂素IBA 0.2 mg/L，以確定不同無機鹽離子強度對杜仲不定芽生根情況的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗每組均接種12個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后，觀察記錄愈傷組織、不定芽和根的生長狀況，統(tǒng)計愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)率及生根率。培養(yǎng)條件為：(25±2) ℃，光照強度為2 500 lx，光照周期為15 h/d。

愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/供試外植體數(shù)×100%；

不定芽誘導(dǎo)率=出現(xiàn)不定芽的外植體數(shù)/供試外植體數(shù)×100%；

增殖系數(shù)=愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽總數(shù)/組合數(shù)；

生根率=可見生根的外植體數(shù)/供試外植體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織條件的確定

2.1.1 以成熟胚為外植體 從表6可以看出，杜仲成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織需要激素參與，單獨使用NAA不能誘導(dǎo)愈傷組織形成，BA與NAA混合使用(愈傷組織生長正常且整體誘導(dǎo)率較高)的效果要好于單獨使用BA(愈傷褐化，誘導(dǎo)率低)。其中以添加BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L的MS培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高,達(dá)77.8%，而且愈傷組織的生長正常，質(zhì)地疏松，顏色為黃色，此類愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)形成不定芽(圖1-1)。

2.1.2 以幼嫩胚為外植體 表7結(jié)果表明，在BA和2,4-D組合中，杜仲幼嫩胚均能正常誘導(dǎo)出愈傷組織，其中以MS+BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L 最好(圖1-2)， 誘導(dǎo)率達(dá)88.9%。而在BA和NAA的組合中，沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，外植體緩慢變黑，壞死。無激素的培養(yǎng)基中同樣未能誘導(dǎo)出愈傷組織，外植體壞死。

2.1.3 以葉片為外植體 由表8可見，以杜仲葉片為外植體時，單獨使用BA無法誘導(dǎo)出愈傷組織，葉片膨大、緩慢干枯死亡。單獨使用NAA時，只有葉片邊緣出現(xiàn)小塊分散的嫩黃色愈傷組織，且長勢較差。只有BA和NAA配合使用才能誘導(dǎo)出比較好的愈傷組織，但是由于黃綠色愈傷組織在芽誘導(dǎo)階段具有較好的細(xì)胞再分化能力，因此選擇MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L作為最佳培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)100%，此類愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)形成不定芽(圖1-3)。

注：小塊為分散在葉邊緣的愈傷，中等為體積超過葉面積一半的愈傷，大塊為全部發(fā)育成愈傷。長勢分為3級：較差、一般、較好。表10，11同。

Note:A small piece is the small callus scattered on the edge of the leaf,medium is the general callus with size bigger than leaf area,large is well developed callus.The growth vigor is divided into three levels:poor,general and good.The same table 10 and 11.

為了進一步了解不同組合對葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響及不同激素之間的關(guān)系，對葉片愈傷組織誘導(dǎo)率進行多因素方差分析，結(jié)果見表9。從表9可以看出，處理的總效應(yīng)(指BA與NAA 2種激素共同參與試驗時，兩者之間交互作用對試驗結(jié)果的影響)P=0<0.05達(dá)到了顯著水平，說明BA和NAA之間的交互效應(yīng)顯著，二者的交互作用對試驗結(jié)果產(chǎn)生了顯著影響。

2.1.4 以莖段為外植體 由表10可見，單獨使用BA時，以杜仲莖段為外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率較低，且顏色深綠，長勢較差，質(zhì)地緊密，不利于繼代增殖和芽誘導(dǎo)。單獨使用NAA時，在試驗范圍內(nèi)，愈傷組織的誘導(dǎo)率均較高，其中以1.5 mg/L最高，達(dá)到100%；隨著NAA質(zhì)量濃度的升高，誘導(dǎo)率逐漸降低，總體上誘導(dǎo)率呈拋物線趨勢。當(dāng)BA質(zhì)量濃度為2.0 mg/L，NAA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率也達(dá)到100%，且顏色為綠色，長勢均良好，此類愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)形成不定芽(圖1-4)。

2.2 杜仲愈傷組織不定芽的誘導(dǎo)條件

由表11可以看出，杜仲愈傷組織叢生芽的誘導(dǎo)需要有BA或BA和NAA同時存在，但以BA與NAA混合使用的效果較好。從不定芽的誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)綜合考慮，適合杜仲愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L(圖2)。

注：增殖系數(shù)為每個愈傷上的叢生芽平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Note:k-factors are average±standard deviation of multiple shoot clumps.

2.3 杜仲不定芽生根的培養(yǎng)條件

2.3.1 IBA和NAA單因素作用于杜仲無菌苗的生根培養(yǎng) 由表12可以看出，杜仲不定芽在沒有激素的情況下容易生根，生根率最高達(dá)到72%，并且根從苗基部長出，粗壯不易脫落，無愈傷組織出現(xiàn)(圖3-1)。而激素的存在反而會抑制根的誘導(dǎo)。

2.3.2 不同培養(yǎng)基中的生根情況 由表13可見，在激素IBA質(zhì)量濃度相同時，隨著培養(yǎng)基中無機鹽離子強度的降低，杜仲不定芽生根率逐漸上升，其中在MS培養(yǎng)基中，植株所長出的根比較短，但粗壯；而在1/2MS和1/4MS培養(yǎng)基中，植株所長出的根數(shù)量明顯增多，長度略有增加，有利于煉苗后的移栽。因此，最適合杜仲幼苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方是1/4MS(圖3-2)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，杜仲愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基分別為：成熟胚MS+BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L， 誘導(dǎo)率77.8%；幼嫩胚MS+BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L， 誘導(dǎo)率88.9%；葉片MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率100%；莖段MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率100%。成熟胚、葉片和莖段誘導(dǎo)的愈傷組織為黃綠色，經(jīng)過繼代培養(yǎng)可以誘導(dǎo)不定芽；但是，幼嫩胚誘導(dǎo)的愈傷組織為乳白色，繼代培養(yǎng)后不能產(chǎn)生不定芽，反而褐化死亡。

杜仲愈傷組織誘導(dǎo)不定芽形成的適合培養(yǎng)基為MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，不定芽誘導(dǎo)率88.9%，增殖系數(shù)為3±1。杜仲的不定芽誘導(dǎo)率不高，且增殖系數(shù)較低，這可能是杜仲組織培養(yǎng)途徑能否在生產(chǎn)上應(yīng)用的一個關(guān)鍵，提高不定芽增殖系數(shù)的方法還有待進一步研究[15-16]。

杜仲的生根相對比較容易，在1/4MS的基本培養(yǎng)基中生根率達(dá)80%，激素的存在不利于生根，這是否是由于杜仲不定芽的內(nèi)源激素水平較高，足夠滿足生根的要求，還有待進一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲在各個生長階段對外界營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。在初代和增殖培養(yǎng)中，較高濃度的無機鹽即MS培養(yǎng)基比較適合，而在生根培養(yǎng)中，低濃度的無機鹽對于生根更加有利。這與前人研究結(jié)果，即大多數(shù)木本植物組織培養(yǎng)中對無機鹽濃度的需求規(guī)律相同[17]。

在愈傷組織的增殖研究中，褐化現(xiàn)象較為明顯和普遍。推測可能的原因有以下幾個方面：①愈傷組織創(chuàng)傷面較多，造成多種化合物和酶接觸發(fā)生氧化反應(yīng)，形成有毒物質(zhì)；②繼代時間過長；③植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度不合適。Rolland等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在接種時外植體一旦被切割，在切傷的組織細(xì)胞表面，酚類化合物和多酚氧化酶就會接觸發(fā)生氧化反應(yīng)，然后形成有毒的醌類物質(zhì)，從而導(dǎo)致褐化的發(fā)生。這種毒性物質(zhì)會逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制植物組織體內(nèi)其他酶的活性，使組織代謝紊亂，對于外植體的分化和脫分化都會產(chǎn)生巨大的不利影響，甚至導(dǎo)致外植體死亡。本研究也在一定程度上印證了上述結(jié)論。針對以上問題，本試驗采取了幾種措施以降低杜仲植株的褐化：①盡量減少愈傷組織的創(chuàng)傷面積，頻繁更換刀片，使得創(chuàng)面盡量平整；②在愈傷組織旺盛生長期即將結(jié)束時就進行愈傷的下一次繼代培養(yǎng)，使得組織體內(nèi)各種酶的活性和新陳代謝速率繼續(xù)維持；③在不影響誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)的前提下，適當(dāng)降低植物生長調(diào)節(jié)劑的質(zhì)量濃度。

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WANG Zheng,WU Jiang-bo,LIU Xue-mei,JIN Xiao-ling

(CollegeofLandscapeArchitecture,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha,Hunan410004,China)

【Objective】 In order to provide basis for transgenic research on bark ofEucommiaulmoidesOliver,the paper established theEommiaulmoidesregeneration system by studying the optimal culture medium for induced callus,induced adventitious bud,and adventitious bud induced roots.【Method】 Mature embryos,young embryos,leaf,and stem were used to find the influence of type and concentration of hormones (BA,NAA,IBA,and 2,4-D) on callus induction,subculture,and rooting ofEucommiaulmoidesOliver.【Result】 All explants could induce callus,but different media were needed.Medium of mature embryo was MS+BA 2.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L with induction rate of 77.8%.Medium of young embryos was MS+BA 0.5 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L with induction rate of more than 88.9%.Medium of leaf blade was MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L with induction rate of 100%.Medium of stem section was MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,with induction rate of 100%.Medium of adventitious bud from callus media was MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L with induction rate of 88.9%,growth rate of 3±1.Rooting medium was 1/4MS with rooting rate of 80%.【Conclusion】 Mature embryo and immature embryo,leaf and stem section ofEucommiaulmoidescan establish regeneration system through callus,but thek-factor of adventitious bud was low.

EucommiaulmoidesOliver;mature embryos;subculture time;adventitious bud;callus

2013-12-20

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目(2012BAD21B0502)

王 征(1986-)，男，河南新鄉(xiāng)人，碩士，主要從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail：362139780@qq.com

金曉玲(1963-)，女，浙江東陽人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事園林植物繁育技術(shù)研究。 E-mail：jxl0716@hotmail.com

時間:2015-06-10 08:40

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.07.032

S336；Q813.1

A

1671-9387(2015)07-0057-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150610.0840.032.html