蔡 博,謝美萍, 顏 勇,林 濤, 陳 衛(wèi)

(1.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210098; 2. 揚(yáng)州自來水有限責(zé)任公司,江蘇 揚(yáng)州 225000)

飲用水中劍水蚤體表攜帶細(xì)菌機(jī)制研究

蔡 博1,謝美萍2, 顏 勇2,林 濤1, 陳 衛(wèi)1

(1.河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,江蘇 南京 210098; 2. 揚(yáng)州自來水有限責(zé)任公司,江蘇 揚(yáng)州 225000)

研究我國飲用水中劍水蚤體表攜帶細(xì)菌的來源,其細(xì)菌種屬、優(yōu)勢菌屬與自然水體中細(xì)菌種屬、優(yōu)勢菌屬的區(qū)別,以及細(xì)菌在劍水蚤體表分布的情況。結(jié)果表明:劍水蚤體表細(xì)菌主要來源于自然水體,其細(xì)菌種屬與自然水體中的細(xì)菌種屬相似度高達(dá)74.8 %,而劍水蚤體表細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬與自然水體中細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬存在的差別較小;自然水體中的優(yōu)勢菌屬在劍水蚤體表不一定是優(yōu)勢菌屬;自然水體中自由細(xì)菌數(shù)量上比劍水蚤體表攜帶的細(xì)菌多。利用綠色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù),發(fā)現(xiàn)標(biāo)記綠色熒光蛋白的大腸桿菌在劍水蚤體表分布不均勻,細(xì)菌主要聚集在劍水蚤足部、尾部等長有剛毛的部位,劍水蚤背部與腹部關(guān)節(jié)部位也附著部分細(xì)菌,雌性劍水蚤的卵囊是細(xì)菌的重要載體。

飲用水;劍水蚤;細(xì)菌種屬;優(yōu)勢菌屬;綠色熒光蛋白;細(xì)菌攜帶機(jī)制

飲用水安全是公共衛(wèi)生安全體系的重要組成部分,與人民身體健康和社會穩(wěn)定息息相關(guān)。2006年我國頒布了新的生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749—2006),與1985年的標(biāo)準(zhǔn)相比,水質(zhì)指標(biāo)由35項(xiàng)增加至106項(xiàng),特別是規(guī)定了隱孢子蟲和賈第蟲(以下簡稱“兩蟲”)的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為小于0.1個/L 。近年來浮游動物作為微生物的攜帶載體,引起的水質(zhì)安全問題成為研究的新熱點(diǎn)。微生物可黏附在浮游動物的體表,使浮游動物成為微生物的攜帶載體[1]。Meinhard等[2]指出,微生物可黏附在浮游動物的體表中,浮游動物體表攜帶的微生物可占水體微生物總量的10%以上。浮游動物具有傳播細(xì)菌的能力,能在單獨(dú)的水層之間向上、向下擴(kuò)散細(xì)菌[3]。Wolmarans等[4]發(fā)現(xiàn),浮游動物個體可攜帶10～400個微生物,包括可引起腹瀉的Aeromonashydrophila和引起腦膜炎的Chryseobacteriummeningosepticum。受到浮游動物的保護(hù),浮游動物所攜帶的微生物具有較強(qiáng)的抗消毒能力,對供水安全造成潛在的威脅。Tang等[5]研究表明,浮游動物的體表保護(hù)使其攜帶的微生物對余氯的抵抗能力增加30～120倍,未被滅活的微生物釋放至水中,3 d內(nèi)恢復(fù)到106 CFU/mL的水平。Grossart等[6]發(fā)現(xiàn)貧營養(yǎng)水體的細(xì)菌比富營養(yǎng)化水體的細(xì)菌能更加牢固地附著于橈足類浮游動物,能更好地抵御環(huán)境波動。國外針對此類焦點(diǎn)問題的研究較早,但對浮游動物黏附細(xì)菌的機(jī)制缺乏探討,細(xì)菌在浮游動物體表分布的情況還未見報道。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能夠揭示DNA序列遺傳多態(tài)性,可以用于鑒定生物種群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,并通過數(shù)據(jù)庫比較鑒定未知微生物,其中基于16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用[7-9]。本文以取自某水廠活性炭濾池的劍水蚤為研究對象,通過PCR-DGGE技術(shù)分析自然水體中細(xì)菌與劍水蚤體表攜帶細(xì)菌的種屬差異,探究劍水蚤體表細(xì)菌來源,分析優(yōu)勢菌屬的變化情況,推測細(xì)菌在自然水體與劍水蚤體表生存環(huán)境的差異。

綠色熒光蛋白標(biāo)記(GFP)是一種細(xì)胞示蹤技術(shù),由于具有自發(fā)熒光等特性,可以用于觀察肉眼無法看到的過程,在生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10-12]。本研究采用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)對大腸桿菌進(jìn)行標(biāo)記,研究大腸桿菌在劍水蚤體表附著分布情況,系統(tǒng)分析細(xì)菌在劍水蚤體表附著機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料與方法

根據(jù)水廠活性炭濾池中水蚤優(yōu)勢種屬分布情況,本文選用橈足類水蚤中最具代表性的劍水蚤作為研究對象。試驗(yàn)中所用的器具和耗材均經(jīng)過高溫滅菌處理,試驗(yàn)在無菌工作室和超凈工作臺上進(jìn)行。

1.1 劍水蚤體表細(xì)菌的提取與檢測方法

劍水蚤樣取自蘇州市某水廠活性炭濾池,取樣時間為2014年5月。原水水溫為24 ℃,pH值為7.7,DO質(zhì)量濃度為7.46 mg/L, BOD5質(zhì)量濃度為1.39 mg/L,TP質(zhì)量濃度為0.03 mg/L,TN質(zhì)量濃度為2.74 mg/L。為研究劍水蚤體表細(xì)菌與自然水體的關(guān)系,試驗(yàn)過程中采用自然水體喂養(yǎng)劍水蚤。喂養(yǎng)1周后,成體劍水蚤死亡,幼體的劍水蚤正好經(jīng)歷了從蚤卵發(fā)育成熟的過程,取這時的成體劍水蚤進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),同時收集部分培養(yǎng)用的太湖水(0.1 mL),用瓊脂培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h,收集的菌樣即為自然水體中自由細(xì)菌。

取15只成體劍水蚤為1組,置于200目無菌濾網(wǎng)上,用無菌磷酸緩沖液沖洗3遍以上,收集最后一次沖洗液(0.1 mL),用瓊脂培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h,檢測水蚤是否沖洗干凈。

將劍水蚤轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,加入28 mL無菌水和2 mL解吸附試劑。解吸附試劑的成分為:氯化鈉9 %、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯1 %、磷酸氫二鈉2.83 %、磷酸二氫鉀1.36 %、無菌水85.81 %。充分混勻后,2 000 rpm、25 ℃,離心3 min,取離心后的上清液,用瓊脂培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h,收集的菌樣即為劍水蚤體表攜帶的細(xì)菌。

1.2 細(xì)菌基因組DNA提取方法

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取水中自由細(xì)菌和劍水蚤體表攜帶的細(xì)菌的基因組DNA。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒由上海捷瑞生物有限公司提供。用提取得到的DNA模板進(jìn)行后續(xù)的PCR-DGGE試驗(yàn),引物使用細(xì)菌V3區(qū)通用引物(由上海生物工程有限公司合成)518 R:5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3;GC338F:5-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGG CGG GGC GGG GGC GCG GGG GGC CTA CGG GAG GCA GC AG-3[13]對模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序設(shè)定為:使用0.2 mL PCR管,采用50 μL系統(tǒng);95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,65 ℃～55 ℃退火,每循環(huán)降低0.5 ℃1 min,72 ℃復(fù)性45 s(共循環(huán)20次);94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃復(fù)性45 s(循環(huán)12次);72 ℃延伸8 min;4 ℃保存(共循環(huán)32次)。DGGE試驗(yàn)采用8%聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度梯度為35 %～65 %,電泳電壓120 V,跑膠8 h,SYBR GreenⅠ染色,切膠回收DNA條帶,再送往上海生物工程有限公司進(jìn)行克隆測序,對DNA測序結(jié)果使用Blast鑒定菌種,并進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。PCR混合液和重蒸水(dd H2O)由上海捷瑞生物有限公司提供。PCR 儀器使用Bio-Rad C1000PCR儀。DGGE電泳儀采用Bio-Rad Dcode通用突變檢測系統(tǒng)(Dcode System for DGGE)。

1.3 劍水蚤體表附著細(xì)菌形成機(jī)制研究方法

為研究水中細(xì)菌在浮游動物體表附著分布情況,需要對細(xì)菌進(jìn)行示蹤標(biāo)記。本研究采用綠色熒光蛋白標(biāo)記法(GFP),考慮到浮游動物體表攜帶細(xì)菌數(shù)量有限,選用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)作為表達(dá)蛋白,表達(dá)載體選用pET-28a,表達(dá)菌株選用大腸桿菌OP50(E. coli OP50)。EGFP、pET-28a由上海生物工程有限公司提供,大腸桿菌OP50購自南京便診生物科技有限公司。

將上述經(jīng)過體表細(xì)菌解吸附的劍水蚤收集置于無菌200目濾網(wǎng)上,用無菌磷酸緩沖液沖洗3遍以上,然后轉(zhuǎn)移至一個100 mL無菌燒杯中,加入約50 mL無菌水,并加入經(jīng)過綠色熒光蛋白表達(dá)的大腸桿菌,使水中大腸桿菌濃度約為108CFU/mL。經(jīng)過3 h,可以認(rèn)為大腸桿菌已經(jīng)充分附著于劍水蚤體表[14]。再將劍水蚤置于200目無菌濾網(wǎng)上,用無菌磷酸緩沖液沖洗3遍以上,充分洗凈未被附著的自由細(xì)菌。用熒光顯微鏡觀察,熒光激發(fā)波波長為484～507 nm。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 劍水蚤體表攜帶細(xì)菌來源

通過PCR-DGGE試驗(yàn),凝膠電泳結(jié)果見圖1。泳道1表示自然水體中的自由細(xì)菌種屬,泳道2表示劍水蚤體表攜帶的細(xì)菌種屬。從圖1中可以直觀地看出劍水蚤體表細(xì)菌與水中自由細(xì)菌種類基本一致,條帶相似性分析證實(shí)了二者相似度高達(dá)74.8%。這表明劍水蚤體表攜帶的細(xì)菌主要來自于水體環(huán)境,且細(xì)菌種類與水中自由細(xì)菌種類高度一致。Tang等[5]認(rèn)為浮游動物攜帶的細(xì)菌與水體中的自由細(xì)菌不是相互孤立的,二者存在一定聯(lián)系。水體中自由細(xì)菌可以附著于浮游動物體表,成為浮游動物體表攜帶的細(xì)菌,同時浮游動物體表攜帶的細(xì)菌也可能由于浮游動物劇烈運(yùn)動,受到水流沖刷作用而進(jìn)入自然水體成為自由細(xì)菌。

注:圖中的數(shù)字為條帶編號對應(yīng)的菌種圖1 細(xì)菌基因組DGGE指紋圖譜及條帶相似性分析結(jié)果

相似度對應(yīng)種屬、DNA測序結(jié)果見表1。使用Quantity One軟件計(jì)算條帶Trace值可以近似分析各菌屬數(shù)量上的差異,Trace值以及換算后菌屬所占比例見表2。結(jié)合表1與表2,可以發(fā)現(xiàn),由于劍水蚤體表與自然水體環(huán)境的差異,導(dǎo)致不同菌屬的數(shù)量也存在差異。如,自然水體中的自由細(xì)菌1號菌屬鮑氏不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiACICU)的數(shù)量約是其在劍水蚤體表的兩倍。而在自然水體中占絕對優(yōu)勢的3號菌屬變形桿菌屬(Betaproteobacteria bacterium)在劍水蚤體表數(shù)量減少較多。整體來看,自然水體中的自由細(xì)菌數(shù)量比劍水蚤體表細(xì)菌豐富。二者在細(xì)菌種類上沒有差異,但是各菌屬所占比例以及優(yōu)勢菌屬種類存在一定差異。

表1 原水水樣中的細(xì)菌及劍水蚤體表

表2 DGGE條帶DNA Quantity Trace值

2.2 劍水蚤體表細(xì)菌分布情況

GFP熒光顯微鏡分析結(jié)果見圖2。劍水蚤身體各部位攜帶細(xì)菌能力不一樣,細(xì)菌主要富集在劍水蚤的足部,而劍水蚤甲殼質(zhì)背部的細(xì)菌很少,也有少部分細(xì)菌藏在劍水蚤背部甲殼的關(guān)節(jié)部位(圖2(A))。劍水蚤的腹部以及尾部也容易黏附細(xì)菌,如圖2(B)和圖2(C)所示。在劍水蚤顎部、腹部與尾部位置有明顯的熒光亮點(diǎn),表明在這些部位含有大量綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)菌。此外,雌性劍水蚤的卵囊也是細(xì)菌的重要載體。從圖2(D)中可以看出,雌性劍水蚤的卵囊部位熒光信號強(qiáng)烈,表明劍水蚤卵囊可以攜帶大量細(xì)菌。

圖2 劍水蚤體表附著綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌

造成細(xì)菌在劍水蚤體表分布不均的主要原因是劍水蚤體表結(jié)構(gòu)的差異。劍水蚤屬于橈足類浮游動物,長有5對作為游泳器官的胸足,具有發(fā)達(dá)的羽狀剛毛。其顎部長有觸角,觸角上也長有羽狀剛毛,方便劍水蚤濾食水中食物。尾叉的背面有縱行隆線,內(nèi)緣有1列剛毛。甲殼類浮游動物剛毛多由幾丁質(zhì)物質(zhì)構(gòu)成。幾丁質(zhì)具有豐富的氨基和羥基,對重金屬離子有較高的絡(luò)合能力,并且能吸附水中的懸浮顆粒,吸附顏料顏色等,是一種天然吸附劑[15],對細(xì)菌也有一定的吸附作用。因而劍水蚤的足部、顎部和尾部是細(xì)菌的主要聚集場所。劍水蚤光滑的甲殼經(jīng)常在游泳的時候受水流沖刷,因而不易穩(wěn)定附著細(xì)菌,但是其甲殼連接部位的節(jié)間膜受水流沖刷作用較小,表面存在就較多褶皺,可以任意折疊,具有較強(qiáng)的可伸縮性和較大的比表面[16],容易黏附水中的營養(yǎng)物質(zhì),是細(xì)菌很好的生長場所,因而在劍水蚤的背部及腹部的關(guān)節(jié)連接部位富集有細(xì)菌。雌性劍水蚤在生殖繁衍時,由輸卵管分泌物把卵集聚成大小、形狀和位置不同的卵囊,懸掛于雌體腹面兩側(cè),形成兩個卵囊。這種輸卵管分泌物在黏附蚤卵的同時,也會附著大量細(xì)菌[17]。翟寶香等[18]通過電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)輪蟲卵表面存在大量氣孔,這些氣孔往往黏附一些物質(zhì)。劍水蚤的蚤卵與輪蟲卵具有相似的結(jié)構(gòu),表面也會有大量氣孔,能吸附水中一些物質(zhì)。這使雌性劍水蚤的卵囊成為細(xì)菌的一個重要載體,雌性劍水蚤能夠比雄性劍水蚤攜帶更多數(shù)量的細(xì)菌[19]。

3 結(jié) 論

a. 劍水蚤體表細(xì)菌主要來源于自然水體,且與水中的自然細(xì)菌存在一定聯(lián)系,二者在一定情況下可以相互轉(zhuǎn)化。

b. 劍水蚤體表細(xì)菌與自然水體中的自由細(xì)菌在種類上趨于一致,二者相似度高達(dá)74.8%,而在優(yōu)勢菌屬種群上存在略微差別。自然水體中占絕對優(yōu)勢的自由細(xì)菌在劍水蚤體表不一定能成為優(yōu)勢菌屬。此外,自由細(xì)菌在數(shù)量上多于劍水蚤體表攜帶細(xì)菌。

c. 劍水蚤體表細(xì)菌分布不均勻,細(xì)菌主要聚集在劍水蚤足部與尾部等長有剛毛的部位,劍水蚤甲殼之間的節(jié)間膜,如背部和腹部的關(guān)節(jié)部位,也長有部分細(xì)菌;雌性劍水蚤的卵囊是細(xì)菌的重要載體,這也是雌性劍水蚤比雄性劍水蚤對飲用水安全威脅更大的一個原因。

d. 劍水蚤不同部位對細(xì)菌的黏附能力不同,不同器官針對細(xì)菌的黏附機(jī)制不同。

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On bacteria-carrying mechanism of surface ofCyclopsin drinking water

CAI Bo1, XIE Meiping2, YAN Yong2, LIN Tao1, CHEN Wei1

(1.CollegeofEnvironment,HohaiUniversity,Nanjing210098,China;2.YangzhouTapWaterCo.,Ltd,Yangzhou225000,China)

The author of this paper researched the source, species and distribution of the bacteria attached to the surface ofCyclops. The results indicate that the bacteria attached to the surface ofCyclopsare from natural water body, and the similarity of the species between the bacteria attached to the surface ofCyclopsand those in natural water body is as high as 74.8 %. There is a little difference between the dominant bacteria species on the surface ofCyclopsand those in natural water body. The dominant bacteria species in nature water body is not the dominant one on the surface ofCyclops. The number of free-living bacteria in natural water body is more than those attached to the surface ofCyclops. A phenomenon is found that bacteria are distributed unevenly on the surface ofCyclopsby using the technology of green fluorescent protein. The bacteria mainly focus on the foot and tail ofCyclops, which are covered with specialized setae. There are also many bacteria attached to the joint of the back and abdomen ofCyclops. The oocyst of femaleCyclopsis another important carrier of bacteria.

drinking water;Cyclops; bacteria species; dominant bacteria species;green fluorescent protein; bacteria-carrying mechanism

10.3880/j.issn.1004-6933.2015.02.008

國家自然科學(xué)基金(51378173)

蔡博(1989—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)轱嬘盟幚碇械母∮蝿游锛?xì)菌攜帶機(jī)制。E-mail: caibolaodi@126.com

Q938.8

A

1004-6933(2015)02-0040-05

2014-07-01 編輯：彭桃英)