王洪權(quán)，王玉敏，崔其福，趙偉麗，王麗娜，張俊毅,4

(赤峰學(xué)院：1. 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰市 024000；2. 附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科； 3. 附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；4. 附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古赤峰市 024005)

◇中醫(yī)藥研究◇

類葉升麻苷通過激活ERK1/2誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1的表達(dá)

王洪權(quán)1,2，王玉敏1,3，崔其福2，趙偉麗2，王麗娜1，張俊毅1,4

(赤峰學(xué)院：1. 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰市 024000；2. 附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科； 3. 附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；4. 附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古赤峰市 024005)

目的 探討類葉升麻苷(actesoide)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(HO-1)表達(dá)的信號(hào)機(jī)制。方法 類葉升麻苷單獨(dú)處理體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞或運(yùn)用ERK1/2抑制劑PD98059預(yù)處理, 提取細(xì)胞蛋白，Western blot方法檢測(cè)pERK1/2和ERK1/2以及HO-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比, 類葉升麻苷可以誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)，類葉升麻苷激活ERK1/2，后者激活介導(dǎo)類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)，因?yàn)镻D98059預(yù)處理后可以減弱類葉升麻苷引起的HO-1蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論 類葉升麻苷通過激活ERK1/2通路誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。

類葉升麻苷；血紅素加氧酶-1；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

篩選出能夠上調(diào)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)表達(dá)的天然化合物成為探討治療氧化應(yīng)激相關(guān)性神經(jīng)退行性疾病治療的新途徑[1]。HO-1的保護(hù)作用引起了研究者的廣泛關(guān)注[2-4]。我們的前期研究表明，天然化合物類葉升麻苷(actesoide, AS)能夠在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，但其上調(diào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。最近研究顯示，MAPKs主要參與ho-1基因的活化，MAPK可參與不同的HO-1誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的ho-1基因的活化機(jī)制[5-6]。因此，本研究將從MAPK通路探討HO-1的表達(dá)機(jī)制，探討類葉升麻苷是否激活MAPK上調(diào)HO-1的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料 類葉升麻苷(分子結(jié)構(gòu)見圖1)購(gòu)自Winherb Medical Technology Inc, HO-1抗體(#SPA895) 購(gòu)自Stressgen公司。rabbit anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antibody (#9101)、rabbit anti-ERK antibody (#9102) 購(gòu)自CST公司。免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence, ECL)購(gòu)自Santa cruz公司，PVDF膜購(gòu)自Millpore公司。

圖1 類葉升麻苷的分子結(jié)構(gòu)圖

Fig.1 Molecular structure of actesoide

1.2 主要儀器 Western Blot電泳儀(Bio-Rad公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，多用脫色搖床(上海新波無線電廠)，超純水凈化儀(Millipore公司)。

1.3 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) PC12細(xì)胞接種在含50 mL/L胎牛血清、100 mL/L馬血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(pH 7.2)，37 ℃、50 mL/L CO2溫育。細(xì)胞接種后每2～3 d換液1次，9/10融合時(shí)轉(zhuǎn)種到相應(yīng)的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板里，溫育48 h后作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

1.4 Western blot 按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[7]。以β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照，計(jì)算待測(cè)蛋白條帶積分吸光度與β肌動(dòng)蛋白的比值，表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。資料采用GraphPad Prism 4.0 Software (GraphPad Software, Inc.,San Diego, CA)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá) 首先檢測(cè)類葉升麻苷對(duì)HO-1表達(dá)的可能影響。類葉升麻苷 (1、20、30 μmol/L)單獨(dú)處理PC12細(xì)胞，提取蛋白，蛋白印記方法檢測(cè)HO-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，類葉升麻苷可誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)(圖2)。

2.2 類葉升麻苷激活ERK通路 為了進(jìn)一步探討類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，首先研究類葉升麻苷是否通過MAPK通路上調(diào)HO-1的表達(dá)。結(jié)果表明，類葉升麻苷激活ERK1/2，類葉升麻苷時(shí)間依賴性(圖3)升高磷酸化水平的ERK1/2。而對(duì)JNK和p38MAPK的激活沒有影響(結(jié)果未顯示)。

圖2 類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1蛋白的表達(dá)

Fig.2 Acteoside induced HO-1 expression in PC12 cells

各種濃度的類葉升麻苷作用于細(xì)胞12 h，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)HO-1和β-actin表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖3 類葉升麻苷激活ERK1/2通路

Fig.3 Actesoide activated ERK kinase pathway

30 μmol/L 類葉升麻苷作用于PC12細(xì)胞不同時(shí)間，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)磷酸化ERK1/2(pERK1/2)和總的ERK1/2。

2.3 ERK抑制劑可抑制類葉升麻苷誘導(dǎo)的ERK激活 類葉升麻苷可以激活ERK，接下來研究ERK抑制劑PD98059是否可以抑制類葉升麻苷誘導(dǎo)的ERK激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑PD98059劑量依賴性降低類葉升麻苷誘導(dǎo)的ERK激活，即磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)的量隨著PD98059劑量的增加而逐漸降低(圖4)。

圖4 ERK抑制劑PD98059劑量依賴性降低類葉升麻苷誘導(dǎo)的ERK激活

Fig.4 PD98059 inhibited actesoide-induced activation of ERK kinase in a dose-dependent manner

ERK1/2抑制劑 PD98059預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入30 μmol/L 類葉升麻苷作用6 h，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)和總ERK1/2。

2.4 類葉升麻苷通過激活ERK誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào) 為了進(jìn)一步闡明ERK1/2通路的激活在類葉升麻苷誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)上調(diào)中的作用，接下來研究PD98059(ERK1/2特異性抑制劑)抑制ERK的激活后對(duì)類葉升麻苷引起的HO-1表達(dá)上調(diào)的影響。結(jié)果顯示，PD98059能夠抑制類葉升麻苷引起的HO-1表達(dá)上調(diào)(圖5)。這表明ERK1/2通路的激活參與類葉升麻苷引起的HO-1表達(dá)上調(diào)。因此，類葉升麻苷可通過激活ERK1/2 通路上調(diào)HO-1的表達(dá)。

圖5 ERK1/2的激活參與類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)

Fig.5 Actesoide upregulated HO-1 expression through activating ERK kinase pathway

ERK1/2抑制劑 PD98059預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入30 μmol/L 類葉升麻苷作用6 h，提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)HO-1和β-actin。與對(duì)照組相比，#P<0.05；與類葉升麻苷單獨(dú)處理組相比，*P<0.05。

3 討 論

類葉升麻苷(actesoide)是一種糖苷類，其最早分離自毛蕊花素(verbascum sinuatum)并被命名為“verbascoside”。1968年， BIRKOFER 闡明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并引進(jìn)了其新的名字“Actesoide”。 以前研究表明，類葉升麻苷具有許多藥理學(xué)活性，如肝保護(hù)活性、抗凋亡活性和抗氧化活性[8-10]。最近研究顯示，類葉升麻苷具有神經(jīng)保護(hù)活性，其可以抑制1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)和谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷[11-13]。另外，AS也可抑制魚藤酮致SH-SY5Y細(xì)胞損傷[14-15]，并在MPTP所致的帕金森病小鼠模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[16]。最近研究顯示，類葉升麻苷可降低tau蛋白的磷酸化而在岡田酸誘導(dǎo)的阿爾茨海默病細(xì)胞模型中發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[17]。目前，AS的保護(hù)作用機(jī)制主要集中在其抗氧化[18]、抗凋亡活性[9]，其藥理學(xué)活性機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。我們前期研究表明，類葉升麻苷可在SD大鼠的皮層神經(jīng)元、紋狀體細(xì)胞、腎臟和肝臟中上調(diào)HO-1的表達(dá)，同時(shí)其亦可在PC12細(xì)胞中上調(diào)HO-1的表達(dá)，但其上調(diào)HO-1的機(jī)制不明。因此，本研究從MAPK信號(hào)通路水平探討類葉升麻苷誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。

前人的研究表明，HO-1誘導(dǎo)劑激活蛋白磷酸化依賴的信號(hào)通路，最終活化調(diào)節(jié)ho-1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。最近研究顯示，MAPKs主要參與ho-1基因的活化，MAPK可參與不同的HO-1誘導(dǎo)劑介導(dǎo)的ho-1基因的活化[5]，MAPK為第一個(gè)確定的參與HO-1的表達(dá)調(diào)節(jié)的激酶。本研究結(jié)果顯示，類葉升麻苷可以時(shí)間依賴性(圖3)激活ERK1/2，而這種激活直接參與類葉升麻苷對(duì)HO-1表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，因?yàn)镋RK1/2特異性抑制劑PD98059抑制類葉升麻苷引起的HO-1表達(dá)上調(diào)。這表明類葉升麻苷通過激活ERK1/2 通路上調(diào)HO-1的表達(dá)。

總之，本研究鑒定出類葉升麻苷為一個(gè)新的誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的新的化合物，其可通過激活ERK1/2來誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)上調(diào)。本研究闡明了類葉升麻苷的新的藥理作用，為進(jìn)一步探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供了依據(jù)，為進(jìn)一步研究類葉升麻苷在氧化應(yīng)激損傷性疾病中的神經(jīng)保護(hù)作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯 韓維棟)

Actesoide induces heme oxygenase-1 expression through activating ERK1/2 pathway

WANG Hong-quan1,2, WANG Yu-min1,3, CUI Qi-fu2, ZHAO Wei-li2, WANG Li-na1, ZHANG Jun-yi1,4

(1. Chifeng Medical College, Chifeng University, Chifeng 024000, China; 2. Department of Neurology; 3. Department of Oncology; 4. Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Chifeng Uinversity, Chifeng 024005, China)

Objective To investigate the molecular mechanism for actesoide inducing heme oxygenase-1 (HO-1) expression through activating ERK1/2 pathway. Methods Cultured PC12 cells were treated with preincubated with or without ERK1/2 inhibitor, PD98059. The expressions of pERK1/2, ERK1/2 and HO-1 protein were measured by Western blot. Results Actesoide induced the upregulated expression of HO-1 in a concentration-dependent manner. Actesoide activated the ERK1/2 cascade. Actesoide treatment resulted in time-related induction of the phosphorylation of ERK1/2 in PC12 cells. Actesoide-induced HO-1 expression was blocked by ERK1/2 inhibitor PD98059 in a concentration-dependent manner. Conclusion Actesoide induces HO-1 expression through activating ERK1/2 pathway.

actesoide; heme oxygenase-1; ERK1/2; expression

2014-02-17

2014-04-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助項(xiàng)目(No.81260196, 81450036, 81201844)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校青年科技英才支持計(jì)劃(No.NJYT-13-B20)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(No.NJZZ12306, NJZZ14271)；國(guó)家社科基金項(xiàng)目(No.13CRK009); 內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2014MS0892, 2014BS0802, 2014MS0814, 2013MS1176) Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81260196, 81450036, 81201844), Program for Young Talents of Science and Technology in Universities of Inner Mongolia Autonomous Region (No.NJYT-13-B20), Scientific Research Projects in Universities of Inner Mongolia Autonomous Region (No.NJZZ12306, NJZZ14271), the National Social Science Foundation of China (No.13CRK009), and the Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomous Region (No.2014MS0892, 2014BS0802, 2014MS0814, 2013MS1176)

王洪權(quán). E-mail: whongquan@alu.fudan.edu.cn

R741.05

A

10.7652/jdyxb201501022

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20141119.0900.007.html(2014-11-19)